《International Journal of Nanomedicine》：Glioma Cell Membrane–Coated CaCO3 Nanoparticles for Localized Postoperative Chemo–Calcium Overload Therapy to Prevent Glioma Recurrence
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这篇研究性论文报道了一种创新性的局部治疗策略。研究者开发了由胶质瘤细胞膜包覆、负载多柔比星（DOX）的碳酸钙（CaCO3）纳米颗粒（CaDM），并将其与临床止血剂 Surgiflo 结合，用于胶质瘤术后切除腔的局部给药。该体系在酸性肿瘤微环境中（TME）响应性降解，同步释放DOX和钙离子（Ca2+），通过协同的直接细胞毒性、钙超载和免疫原性细胞死亡（ICD）等多种机制，有效抑制了术后复发，展示了显著的临床转化潜力。
引言
胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其临床治疗面临血脑屏障（BBB）限制、标准化疗药物替莫唑胺疗效有限以及高复发率等挑战。近90%的复发发生在原切除腔2厘米范围内，因此局部给药策略备受关注。纳米药物，特别是具有良好生物相容性和pH响应降解特性的碳酸钙（CaCO3）纳米载体，为提高局部药物浓度和减少全身暴露提供了可能。此外，细胞膜包覆技术可赋予纳米载体同源靶向能力，而临床应用的止血材料（如Surgiflo）作为载体可实现药物的均匀分布和缓释。基于此，本研究旨在开发一种集成了生物膜包覆靶向递送与临床局部制剂的新型多功能治疗平台，以应对术后胶质瘤复发的难题。
材料与方法
本研究首先采用气扩散法合成了负载多柔比星（DOX）的CaCO3纳米颗粒（CaD）。随后，提取胶质瘤GL261细胞的细胞膜，通过超声等方法将其包覆在CaD表面，制备得到仿生纳米平台（CaDM）。通过透射电镜（TEM）、能量色散X射线光谱（EDS）、Zeta电位、紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）以及蛋白质凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western Blot）等方法对纳米颗粒的形貌、尺寸、元素组成、表面性质、药物负载及膜蛋白保留进行了全面表征。在细胞水平，评估了CaDM的pH响应性释放行为、对胶质瘤细胞（U251 MG）和正常星形胶质细胞（HA1800）的选择性摄取能力、体外细胞毒性，并深入探究了其诱导钙离子（Ca2+）超载、活性氧（ROS）积累、线粒体膜电位（JC-1检测）及结构损伤的机制。同时，通过检测钙网蛋白（CRT）膜暴露、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）释放和细胞外三磷酸腺苷（ATP）分泌，以及评估其诱导树突状细胞（DC）成熟的能力，验证了CaDM诱导免疫原性细胞死亡（ICD）的潜能。
在体内研究中，建立了原位胶质瘤（GL261-LUC）小鼠模型，进行次全切除术后，将CaDM与Surgiflo混合形成CaDM@Surgiflo复合物，局部注入肿瘤腔。通过活体生物发光成像监测肿瘤复发、记录生存期和体重变化以评估疗效。实验终点时，收集脑组织和主要器官进行苏木精-伊红（HE）染色、免疫组织化学（IHC）染色（检测Bax，Caspase-3，Ki67，Bcl-2，PCNA，CRT，HMGB1，组织蛋白酶B，以及血管内皮标志物CD31和血管内皮生长因子）、TUNEL凋亡检测、马松（Masson）染色以及肿瘤组织钙离子含量测定。此外，通过流式细胞术分析了肿瘤组织中DC成熟标志物（CD80、CD86）、CD4+和CD8+T细胞、调节性T细胞（Treg）的浸润情况，并检测了肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）的水平。还通过血液生化和血常规检测、以及主要器官的HE染色进行了安全性评估。所有数据分析均使用GraphPad Prism软件进行统计学处理。
结果与讨论
CaDM的制备与表征
成功制备了CaDM纳米颗粒。TEM显示其形态规则、分布均匀，粒径约100纳米，包覆的细胞膜层厚度约10纳米。Zeta电位在膜包覆后变得更负，证实了膜的成功附着。EDS证实了钙、磷、氧元素的均匀分布。紫外吸收光谱显示了DOX的特征峰。考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹分析证实了胶质瘤细胞膜特征蛋白（如CD44， CD47， PD-L1， Na+/K+-ATP酶）在纳米颗粒表面的成功保留。DOX的载药效率为9.7%。
体外酸响应释放与同源靶向性
CaDM在酸性条件下（pH 5.5和6.5）的降解显著加快，DOX和Ca2+的释放速率和累积释放量均高于中性条件（pH 7.4），展现出良好的pH响应性。细胞摄取实验表明，CaDM能被U251 MG胶质瘤细胞高效摄取，且摄取量显著高于未包膜的CaD组和正常HA1800星形胶质细胞，体现了优异的同源靶向性。CCK-8和活-死细胞染色实验证实，CaDM在酸性环境下（pH 6.5）对GL261胶质瘤细胞的抑制和杀伤作用更强。
CaDM的体外抗肿瘤机制
CaDM被细胞摄取后，在酸性溶酶体/内体环境中迅速降解，大量释放DOX和Ca2+。荧光检测显示，CaDM处理组细胞内Ca2+和ROS水平显著升高，表明引发了钙超载和剧烈的氧化应激。线粒体膜电位检测（JC-1）显示绿色荧光增强（单体形式，代表膜电位下降），红色荧光减弱（聚合体形式，代表正常膜电位），证实线粒体功能严重受损。线粒体特异性染料（MitoTracker Green）染色进一步显示线粒体数量减少，结构遭到破坏。
在诱导ICD方面，免疫荧光和蛋白质印迹结果显示，CaDM处理显著上调了肿瘤细胞膜上的CRT表达，并促进了HMGB1从细胞核向胞外的释放。同时，细胞培养上清中的ATP和HMGB1分泌水平也显著增加。将经CaDM预处理的胶质瘤细胞与骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）共培养后，流式细胞术分析显示BMDCs的成熟标志物CD80和CD86的表达显著上调。这些结果综合表明，CaDM能通过DOX的直接作用和钙超载引发的ROS积累，协同诱导胶质瘤细胞发生ICD，进而激活DC。
CaDM@Surgiflo的体内抗肿瘤疗效
在胶质瘤术后复发模型中，局部应用CaDM@Surgiflo显著抑制了肿瘤的生长。活体成像显示，该治疗组的肿瘤荧光信号远弱于对照组。生存分析表明，CaDM@Surgiflo将小鼠的中位生存期从14天延长至40天，并减轻了体重下降。HE染色显示，该治疗组肿瘤组织细胞排列松散，复发肿瘤体积更小。
机制相关的组织学分析提供了更多证据：IHC结果显示，CaDM@Surgiflo组肿瘤组织中促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2和增殖标志物Ki67、PCNA表达下调。TUNEL染色证实该组肿瘤细胞凋亡率最高。此外，该组肿瘤组织内Ca2+含量显著升高，ROS水平也明显增加。
在血管影响方面，IHC显示血管标志物CD31和血管内皮生长因子（VEGF）的表达在CaDM@Surgiflo组降低，马松和HE染色观察到更高比例的微血管血栓形成，表明释放的Ca2+作为凝血相关因子，诱发了肿瘤血管的血栓形成，实现了“饥饿疗法”效果。
重要的是，CaCO3降解中和了酸性肿瘤微环境，导致组织蛋白酶B（CTSB）的表达下调。CTSB的下调不仅抑制了肿瘤的侵袭和血管生成，还有助于逆转免疫抑制微环境。同时，IHC显示该组肿瘤细胞HMGB1表达下降，CRT表达升高，与体外ICD诱导结果一致。
体内免疫响应激活
免疫荧光和流式细胞术分析揭示了CaDM@Surgiflo强大的免疫调节能力。肿瘤组织中表达CD80和CD86的成熟DC数量显著增加。同时，杀伤性CD8+T细胞和辅助性CD4+T细胞的浸润大幅增强，而具有免疫抑制功能的调节性T细胞（Treg）比例则显著下降。此外，肿瘤组织内促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ的水平也显著上调。这些结果表明，局部CaDM@Surgiflo治疗通过诱导ICD，有效重塑了肿瘤免疫微环境，激发了强大的抗肿瘤免疫反应。
安全性与临床转化潜力
安全性评估显示，各治疗组小鼠的主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）HE染色未见明显病理损伤，血液生化指标（如ALT， AST， BUN， Ca2+）和血常规参数（WBC， HGB， RBC）均在正常范围内，表明该局部递送策略具有良好的生物安全性。
本研究整合了多种优势：CaCO3纳米材料生物相容性好且已获FDA批准作为药用辅料；细胞膜包覆提供了精准的靶向性；DOX是强效的ICD诱导剂；钙超载本身也能诱导ICD并引发血管栓塞；临床应用的Surgiflo不仅提供了止血功能，还优化了纳米颗粒的空间分布和缓释特性。这种多机制协同的策略为预防胶质瘤术后复发提供了一种极具临床转化前景的新方法。当然，该技术在大规模制备的批次稳定性、膜包被工艺的质量控制以及局部高剂量钙离子的长期安全性等方面仍需进一步优化和评估。
结论
本研究成功构建了一种胶质瘤细胞膜包覆的碳酸钙仿生纳米递送系统（CaDM）。将其与临床止血材料Surgiflo结合，用于胶质瘤术后切除腔的局部给药，在动物模型中显著抑制了肿瘤复发并延长了生存期。其作用机制是多方面的：在酸性肿瘤微环境中，CaCO3响应性降解，同步释放DOX和Ca2+；DOX直接杀伤肿瘤细胞并诱导ICD；Ca2+则通过引发钙超载导致线粒体损伤、ROS积累以增强ICD，同时促进肿瘤血管血栓形成；此外，CaCO3降解中和酸性环境，下调CTSB表达，有助于逆转免疫抑制。这些协同作用最终导致DC成熟、细胞毒性T淋巴细胞浸润增强，从而激活有效的抗肿瘤免疫应答。该研究为开发临床可转化的、用于预防胶质瘤术后复发的局部联合疗法提供了新的思路和实验依据。
