新型6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶基PARP1/ATR双靶点抑制剂的研发：为三阴性乳腺癌提供突破性治疗策略

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Design, synthesis and anti-breast cancer activity evaluation of 6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidine-based PARP1/ATR dual inhibitors

本综述系统阐述了针对三阴性乳腺癌治疗瓶颈所设计的新型PARP1/ATR双靶点抑制剂的研发历程。通过巧妙整合PARP1抑制剂（PARPi）的药效团与ATR抑制剂（AZD6738）骨架，研究者成功构建了具有协同抗肿瘤活性的6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶衍生物系列。其中，先导化合物38a展现出纳摩尔级的双靶点抑制效力（IC50均＜20 nM），在MDA-MB-231与MDA-MB-468细胞系中表现出远超尼拉帕利（Niraparib）与AZD6738联合用药的增殖抑制、细胞周期阻滞、凋亡诱导及DNA损伤修复抑制能力。此工作不仅验证了双重靶向PARP1与ATR在克服现有PARPi耐药性方面的巨大潜力，更为开发针对BRCA野生型三阴性乳腺癌的有效疗法提供了坚实的理论与实验基础。

　　

针对三阴性乳腺癌（尤其是BRCA1/2野生型）中PARP1抑制剂（PARPi）单药疗效有限及耐药问题，本研究旨在开发一种新型的双靶点抑制剂，通过同时抑制PARP1与ATR（ATaxia Telangiectasia and Rad3-related）激酶，以实现协同抗肿瘤效应并克服耐药。

研究首先证实了临床已批准的PARPi尼拉帕利（Niraparib）与ATRi AZD6738在1:1摩尔比联用时，对三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的增殖具有显著的协同抑制效果，其联合指数（CI）为0.32，这为设计单一分子的双靶点抑制剂提供了理论基础。

基于此，研究者进行了合理的药物设计。他们以先前报道的双靶点抑制剂PAB-13（化合物15）为起点，旨在改善其药代动力学性质。设计策略聚焦于两个主要系列：系列I和系列II。系列I主要探索了连接ATR靶向药效团的区域A（Region A）的结构多样性，通过取代（R）-3-甲基吗啉等基团来调节对PARP1、PARP7和ATR的选择性与活性。系列II则旨在优化连接子（linker）并替换PARP靶向药效团（如将尼拉帕利的药效团替换为维利帕利（Veliparib）的药效团），以进一步提升双靶点抑制效力并降低对PARP7的脱靶活性。

化学合成部分详细阐述了系列I（化合物27a–27k）和系列II（化合物33a–33b、38a–38b、42a–42d、43）目标化合物的多步合成路线，涉及酰胺偶联、亲核取代、Suzuki偶联、保护基脱除、还原胺化及环化等反应，并通过核磁共振氢谱（¹H NMR）、质谱等手段对关键中间体及终产物进行了结构确证。

体外酶活性评估显示，系列I化合物中，化合物27a（带有（R）-3,4-二甲基吗啉）表现出较好的双靶点抑制潜力（PARP1 IC₅₀: 907 nM; ATR IC₅₀: 9.00 nM），但同时对PARP7抑制较强（IC₅₀: 4.40 nM）。构效关系（SAR）分析表明，吗啉类取代基有助于平衡PARP1与ATR抑制，而更刚性的环状结构或无取代基往往以牺牲PARP1活性为代价增强ATR选择性。系列II化合物通过连接子优化取得了显著进展。特别是化合物38a和38b，采用羰基连接子，在保持对PARP1（IC₅₀: 5 nM和8.50 nM）和ATR（IC₅₀: 14.70 nM和27.70 nM）强效抑制的同时，完全消除了对PARP7的抑制（IC₅₀> 1000 nM）。系列II中的化合物42c（五元环连接子）甚至实现了对PARP1的亚纳摩尔级抑制（IC₅₀: 0.97 nM）。

细胞水平抗增殖实验进一步验证了先导化合物的效力。在MDA-MB-231（BRCA野生型）和MDA-MB-468（携带BRCA1突变）两种三阴性乳腺癌细胞系中，化合物38a的表现最为突出。它对MDA-MB-468细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）达到了惊人的0.01 μM，对MDA-MB-231细胞的抑制也极强（IC₅₀< 0.048 μM），其活性远超尼拉帕利与AZD6738的联合用药。

为了深入阐明化合物38a的作用机制，研究者进行了一系列细胞生物学实验。结果显示，38a能显著诱导MDA-MB-231细胞发生G0/G1期周期阻滞，这与尼拉帕利主要引起S期阻滞不同，暗示了其独特的作用模式。同时，38a能剂量依赖性地促进细胞凋亡，通过Annexin V/PI染色及Western blot检测发现，它下调了抗凋亡蛋白BCL-2和Caspase-3的水平，而上调了促凋亡蛋白BAX的表达。此外，38a还能有效抑制细胞的克隆形成能力和迁移能力。

机制研究的核心在于DNA损伤修复通路。免疫荧光和Western blot分析证实，38a处理显著增加了DNA双链断裂标志物γH2AX的焦点形成和蛋白水平，表明其严重破坏了DNA损伤修复。更重要的是，它能够抑制ATR及其下游效应蛋白CHK1的磷酸化，同时下调磷酸化p53（p-p53）和p21蛋白的表达，从而阻断了ATR-CHK1-p53-p21这条关键的DNA损伤应答与细胞周期检查点通路。

选择性谱分析显示，化合物38a对PARP1和ATR表现出高度选择性，对相关激酶如mTOR、ATM、PI3Kα和DNA-PK的抑制活性很弱或没有，这降低了潜在的脱靶风险。

分子对接研究为38a的双靶点抑制特性提供了结构层面的解释。对接至PARP1（PDB: 7KK6）时，其苯并[d]咪唑-7-甲酰胺药效团能与Gly863、Ser904、Arg878等关键残基形成氢键，吡咯并嘧啶核心与Tyr907存在π-π堆积。对接至作为ATR替代模型的PI3Kα突变体（PDB: 5UK8）时，38a能与Val851、Asp810、Ser854、Asn853等残基形成多个氢键，其连接子区域还与Trp850存在π-π相互作用，这些相互作用可能增强了其与ATR的结合亲和力。

综上所述，本研究成功设计并合成了一系列新型的6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶基PARP1/ATR双靶点抑制剂。先导化合物38a在酶水平和细胞水平均表现出卓越的双重抑制活性和选择性，能通过诱导G0/G1期阻滞、促进凋亡、抑制克隆形成与迁移，以及破坏DNA损伤修复通路（特别是ATR-CHK1-p53-p21轴）等多种机制发挥强大的抗三阴性乳腺癌作用。这些发现不仅为克服PARPi耐药性提供了有前景的新策略，也凸显了PARP1/ATR双靶点抑制在三阴性乳腺癌治疗中的巨大潜力，为后续的临床前及临床研究奠定了坚实的基础。