《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Design, synthesis and biological evaluation of novel KRAS-G12D inhibitors
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本研究聚焦于开发靶向KRAS-G12D突变的新型小分子抑制剂。KRAS-G12D是胰腺癌和结直肠癌的关键驱动因子，但因其独特的结构特征而难以靶向。研究者通过人工智能辅助的从头设计，合成并评估了一系列化合物，其中GD-2与GD-4表现出亚纳摩尔级别的结合亲和力（Kd分别为146 nM和3.18 nM），并能在KRAS-G12D突变癌细胞（AGS和ASPC1）中有效抑制细胞增殖（IC50在0.2至1.8 μM范围），同时显著降低下游信号蛋白磷酸化ERK（p-ERK）的表达。该研究为攻克“不可成药”靶点KRAS-G12D提供了新的候选化合物。
前言
KRAS（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）是人类癌症中最常发生突变的癌基因之一，在大约30%的人类肿瘤中存在突变。其中，发生在第12位密码子的甘氨酸到天冬氨酸的突变（G12D）尤为常见，是胰腺癌和结直肠癌的主要驱动因素，可导致KRAS蛋白持续激活，进而异常激活下游的RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT-mTOR等信号通路，促进肿瘤细胞的生存、增殖和迁移。尽管针对KRAS-G12C突变的共价抑制剂（如sotorasib和adagrasib）已取得突破，但由于G12D突变位点缺乏像半胱氨酸（Cys）那样的高活性亲核残基，传统的共价抑制策略失效，使得KRAS-G12D长期被视为“不可成药”靶点，开发高效、选择性的非共价抑制剂成为亟待解决的挑战。
材料与方法
本研究采用了一种多层次的药物发现策略。首先，利用内部开发的、集成人工智能（AI）技术的从头设计（de novo）小分子生成工具，基于已知KRAS-G12D抑制剂（如MRTX-1133）的结构特征，构建了一个庞大的化合物库。随后，使用薛定谔（Schrodinger）软件的Glide模块对化合物库进行虚拟筛选，以结合亲和力（Glide得分和能量）为主要指标进行初步筛选，并使用MRTX-1133的共晶结构进行对接验证以确保方法可靠性。
在合成方面，选中的先导化合物GD-2和GD-4通过一系列化学反应成功制备，其结构经过核磁共振氢谱（1H NMR）、碳谱（13C NMR）和质谱（MS）确证。合成路线涉及亲核芳香取代（SNAr）和铃木偶联（Suzuki coupling）等关键步骤。
生物学评价体系包括：
- 1.
细胞活力测定：使用WST-8法检测化合物对KRAS-G12D突变癌细胞系（AGS和ASPC1）、KRAS-G12S突变细胞（A549）以及正常细胞（HEK293）的增殖抑制活性，并计算半数抑制浓度（IC50）。
- 2.
蛋白结合实验：采用微量热泳动技术（Microscale Thermophoresis, MST）精确测定化合物与纯化KRAS-G12D蛋白的结合亲和力，获得解离常数（Kd）。
- 3.
信号通路分析：通过Western blot（使用ProteinSimple WES系统）检测化合物处理后，癌细胞中下游信号分子磷酸化ERK（p-ERK）水平的变化，以评估其对KRAS信号通路的抑制效果。
- 4.
分子动力学模拟：利用GROMACS软件对化合物与KRAS-G12D的复合物进行200纳秒的分子动力学模拟，分析复合物的均方根偏差（RMSD）、氢键数量、回转半径（Rg）、溶剂可及表面积（SASA）以及结合自由能（MM/PBSA计算），从原子层面验证结合的稳定性与机制。
结果与讨论
计算化学与虚拟筛选
虚拟筛选流程成功识别出多个具有潜力的KRAS-G12D结合分子。对接验证显示，重新对接的MRTX-1133与晶体结构中的构象高度重合，证实了筛选方法的可靠性。最终选定的GD-2和GD-4展示了优异的对接参数，其结合模式分析表明，两者均能与KRAS-G12D蛋白的Switch-II口袋关键残基形成稳定的氢键相互作用，特别是与突变残基ASP12以及附近的GLU63、ARG68、HIS95、ASP69等发生作用，这些相互作用对于稳定抑制剂结合和实现突变选择性至关重要。
体外抗增殖活性与选择性
细胞实验结果表明，GD-2和GD-4对KRAS-G12D突变的AGS和ASPC1细胞株表现出强效的抗增殖活性，IC50值在纳摩尔至低微摩尔范围内。重要的是，这两种化合物对KRAS野生型的HEK293正常细胞以及KRAS-G12S突变的A549细胞没有明显抑制作用，显示了良好的突变选择性。这初步验证了它们作为选择性KRAS-G12D抑制剂的潜力。
蛋白结合亲和力
MST结合实验数据进一步证实了GD-2和GD-4与KRAS-G12D蛋白的高亲和力。测得GD-2的Kd值为146 nM，而GD-4的亲和力更高，Kd值达到3.18 nM，进入亚纳摩尔级别。这些定量数据与虚拟筛选的预测及细胞活性结果相吻合，强有力地支持了二者是KRAS-G12D的有效抑制剂。
下游信号通路抑制
Western blot分析显示，在ASPC1细胞中，GD-2和GD-4能够剂量依赖性地降低磷酸化ERK（p-ERK）的水平。由于p-ERK是RAS-RAF-MEK-ERK信号通路下游的关键效应分子，其水平的降低直接证明了这两种化合物可以有效阻断由KRAS-G12D突变驱动的致癌信号传导，从功能上阐释了其抑制细胞生长的分子机制。
分子动力学模拟揭示结合稳定性
为期200纳秒的分子动力学模拟为化合物与靶点的结合提供了动态视角。分析表明，GD-2和GD-4与KRAS-G12D形成的复合物在整个模拟过程中保持稳定：
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均方根偏差：复合物的RMSD值较低且平稳，表明整体结构构象稳定。
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氢键网络：两者在整个模拟期间平均维持着约4个稳定的氢键，这与对接预测的关键相互作用位点一致，是结合稳定的重要因素。
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结构紧凑性：回转半径分析显示复合物结构紧凑；溶剂可及表面积数值一致且相对较低，提示结合口袋封闭良好，溶剂难以侵入。
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结合自由能：MM/PBSA计算得出的结合自由能（ΔG）均为较大负值（GD-2: -40.29 kcal/mol；GD-4: -45.27 kcal/mol），从热力学上证实了结合是一个自发且有利的过程。两者结合自由能无统计学显著差异，暗示它们具有相似的结合强度和机制。
结论
本研究成功运用人工智能辅助的理性药物设计、多层级虚拟筛选与系统的实验验证，发现了两个新型、高效、选择性的KRAS-G12D小分子抑制剂GD-2和GD-4。它们不仅在与靶蛋白的生化结合实验中表现出高亲和力，更能在细胞水平上有效抑制KRAS-G12D突变癌细胞的增殖，并通过阻断下游ERK磷酸化发挥功能。分子动力学模拟从原子动力学层面揭示了其稳定结合的机制。这些综合数据表明，GD-2和GD-4是针对KRAS-G12D这一重要癌症靶点的有前景的先导化合物，为后续的优化开发以及最终为胰腺癌、结直肠癌等患者提供新的治疗选择奠定了坚实的基础。未来的研究需要进一步开展临床前药代动力学、药效学及安全性评价，并深入探索其潜在的耐药机制。
