分子杂交策略驱动的间位取代双芳基磺酰胺苯类Keap1-Nrf2 PPI抑制剂的设计与优化

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Design and optimisation of meta-substituted bis(arylsulfonamido)benzene inhibitors through a molecular hybridisation strategy targeting the Keap1-Nrf2 protein-protein interaction

本论文通过分子杂交策略，设计并优化了一系列新型间位取代双芳基磺酰胺苯类衍生物，作为Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用（PPI）的非共价抑制剂。研究发现了先导化合物7a，并经过系统性的构效关系（SAR）优化，获得了高活性（FP/TR-FRET IC50~180/107.5 nM）且代谢稳定（人肝微粒体30分钟残留率达93.9%）的化合物13b。该研究为开发用于治疗氧化应激相关疾病（如恶性肿瘤、COPD、神经退行性疾病等）的Nrf2通路调节剂提供了新型骨架和重要设计思路。

　　

引言

氧化应激与多种疾病的发病机制密切相关，包括恶性肿瘤、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、多发性硬化症（MS）及多种神经退行性疾病。核因子E2相关因子2（Nrf2）是细胞抗氧化防御途径的核心调节因子，通过与抗氧化反应元件（AREs）结合，调控大量抗氧化和解毒基因的转录与表达，从而对抗氧化应激损伤。在静息状态下，Nrf2的活性被Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）所抑制。Keap1作为衔接蛋白，与Cul3-RBX1 E3泛素连接酶复合物相互作用，介导Nrf2的快速蛋白酶体降解，维持其低水平。

当细胞受到亲电试剂或活性氧（ROS）等氧化应激刺激时，Keap1的IVR和BTB结构域中反应性半胱氨酸残基被共价修饰，导致Keap1-Nrf2结合被破坏，Nrf2泛素化被抑制。新合成的Nrf2得以进入细胞核，与Maf蛋白等转录辅助因子形成二聚体，激活ARE驱动的基因转录，上调血红素加氧酶-1（HO-1）、谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCL）等细胞保护蛋白的表达。

因此，靶向Keap1-Nrf2 PPI是调节Nrf2活性、治疗氧化应激相关疾病的一个极具前景的策略。与早期通过共价修饰Keap1半胱氨酸残基间接激活Nrf2的策略（如已获批药物富马酸二甲酯、奥马韦罗酮）相比，开发直接、非共价的Keap1-Nrf2 PPI小分子抑制剂具有更高的选择性，能减少脱靶效应。然而，Keap1 Kelch结构域的底物结合口袋大且富含精氨酸，设计兼具高活性、良好选择性和类药性质的抑制剂仍具挑战。

结果与讨论

设计思路

为设计新型非共价Keap1-Nrf2 PPI抑制剂，研究团队采用了分子杂交策略，结合已知高活性抑制剂的关键化学特征。研究以两种已报道的抑制剂2a（1,4-二氨基萘系列）和3a（3-苯基丙酸系列）为起点。分析其与Keap1 Kelch结构域（PDB: 4XMB, 5FNT）的结合模式发现，该结合口袋可分为五个亚口袋（P1-P5）。2a能占据全部五个亚口袋，而3a仅占据四个（未占据P2）。基于此，团队将3a的对氯苯基核心与2a的片段组合，设计了三个杂交分子7a、8和9。分子对接预测显示，7a和9能占据全部五个亚口袋，而8未能占据极性P2口袋。

化学合成

通过多条合成路线，成功合成了系列目标化合物。如合成路线所示，主要通过还原胺化、硝基还原、磺酰化、烷基化和皂化等关键步骤，构建了具有不同核心取代基（R₁）、苯磺酰胺取代基（R₂）和连接链（X）的间位取代双芳基磺酰胺苯类衍生物。

FP（荧光偏振）实验中的生物学评估与构效关系（SAR）探索

初步筛选发现，杂交化合物7a在FP实验中表现出良好的抑制活性（IC₅₀= 1.91 μM），而8和9在50 μM浓度下仅显示微弱抑制。因此，选择7a作为先导化合物进行系统的SAR研究。

研究围绕核心苯环上的取代基（R₁）、苯磺酰胺上的取代基（R₂）以及连接链（X）的长度进行优化。

1. 1.
   R₁取代基的影响：无论连接链长度和极性如何，在苯环对位引入羟基（OH）均能赋予化合物最高的抑制活性。例如，化合物10（羟基，亚甲基链）、13a-c（羟基，乙基链）和16-17（羟基，更长链）的IC₅₀值均低于1.5 μM。相比之下，甲基或氟取代的类似物活性较低。在4-羟基苯基核心系列中，将连接链从亚甲基（10， IC₅₀= 1.08 μM）延长至乙基（13a， IC₅₀= 0.44 μM）能显著提升活性；但进一步延长至乙氧基（16）或丙基（17）则导致活性下降。
2. 2.
   连接链（X）长度的影响：乙基链被证明是最佳长度。对于甲基取代的R₁，从无链（11b）或亚甲基链（7d）延长至乙基链（12a）或乙氧基链（15a）能提高活性。
3. 3.
   R₂取代基的影响：在苯磺酰胺的4位上，甲基取代普遍能带来更高的效力。在4-羟基苯基核心系列中，化合物13b（R₂= 甲基）的活性（IC₅₀= 0.18 μM）优于甲氧基（13a）或苯基（13c）取代的类似物。
   综合SAR分析，化合物13b脱颖而出，成为该系列中活性最强的类似物，其FP实验IC₅₀为183.4 nM，较先导化合物7a提高了约10倍。

化合物13b的TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）实验评估

为了确认FP实验的结果，对亚微摩尔级活性的化合物进行了TR-FRET验证实验。在该实验中，13b同样表现出强效抑制活性，IC₅₀为107.5 nM，与FP实验结果一致，证实了其作为高效Keap1-Nrf2 PPI抑制剂的潜力。

化合物13b在人肝微粒体中的代谢稳定性

早期药物发现中，代谢稳定性是关键参数。评估显示，13b在人肝微粒体中孵育30分钟后，母体化合物残留率高达93.9%，优于阳性对照化合物2a（87.4%），表明该骨架具有良好的代谢稳定性，有利于进一步的开发。

分子对接分析

分子对接模拟揭示了7a和13b与Keap1 Kelch结构域（PDB: 5FNT）的结合模式差异。7a的较短亚甲基连接链限制了其与P2亚口袋中极性残基的有效相互作用。而13b的较长乙基连接链使其能更好地延伸进入P2口袋，与Asn414和Asn382形成氢键，同时其乙酸盐基团与P1口袋的Arg483形成更强的氢键（键角更接近180度）。此外，其苯磺酰胺的苯环与P4口袋的Tyr525存在π-π堆积作用。这些更优的相互作用解释了13b相比7a约11倍的效力提升。

结论

本研究通过分子杂交策略，成功设计并合成了一系列新型的间位取代双芳基磺酰胺苯类Keap1-Nrf2 PPI抑制剂。通过系统的SAR研究，明确了构效关系：苯环对位的羟基（R₁）、乙基连接链（X）以及苯磺酰胺4位的甲基（R₂）是获得高活性的关键因素。最优化合物13b在FP和TR-FRET实验中均显示出纳摩尔级的抑制活性（IC₅₀分别为183.4 nM和107.5 nM），并在人肝微粒体中表现出优异的代谢稳定性。分子对接分析为其高效力提供了结构基础。该研究不仅发现了一个具有良好开发潜力的新型抑制剂骨架，也为针对Keap1-Nrf2 PPI的后续药物设计与优化提供了清晰的指导框架。