《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Design, synthesis and biological evaluation of donepezil-safinamide hybrids as dual AChE and MAO-B inhibitor for Alzheimer’s disease treatment
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这篇研究致力于解决阿尔茨海默病（AD）缺乏有效疾病修饰疗法的难题。文章采用多靶点定向配体（MTDLs）策略，设计并合成了一系列多奈哌齐与沙芬酰胺的杂合物，旨在同时靶向乙酰胆碱酯酶（AChE）和单胺氧化酶B（MAO-B）。其中，优化化合物28c展现出对AChE和MAO-B的双重、可逆且高效的抑制活性，并能有效穿透血脑屏障（BBB），在小鼠体内表现出良好的安全性和缓解AD症状、保护海马神经元的潜力，为开发新型抗AD候选药物提供了有力支持。
引言
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是全球最常见的神经退行性疾病，主要病理特征为淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）斑块和神经纤维tau缠结的积聚。该病累及全球超过5000万人，且因预期寿命延长而迅速增加，给患者、照料者及社会带来沉重的经济负担。然而，目前尚无疗法能明确阻止或逆转AD的进展，凸显了开发新型抗AD药物的紧迫性。
AD的发病机制复杂，涉及胆碱能神经传递失调、氧化应激增加、Aβ异常沉积、tau蛋白过度磷酸化、神经炎症等多种因素。其中，胆碱能失调与AD患者的认知功能衰退直接相关，因为胆碱能神经递质乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）介导大脑的记忆形成与提取。在AD患者脑中，胆碱能神经元显著变性死亡，导致脑内ACh水平显著降低，构成核心临床症状。乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）是水解ACh的关键酶，其抑制剂（如多奈哌齐）是目前临床使用的基石性对症治疗药物。
单胺氧化酶B（monoamine oxidase-B, MAO-B）是AD的另一个生物标志物。在AD患者的海马体和大脑皮层中，MAO-B在Aβ沉积周围显著上调。过度表达的MAO-B催化内源性和膳食胺类氧化脱氨，产生过量的活性氧（reactive oxygen species, ROS），从而加剧氧化应激和神经炎症，最终导致神经元死亡和认知衰退。此外，MAO-B活性升高可直接刺激β-和γ-分泌酶，促进淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）的淀粉样和非淀粉样裂解，从而加速病理性的Aβ沉积。因此，抑制MAO-B有潜力延缓疾病进展。
鉴于AD的多因素神经退行性病理特征，“多靶点定向配体”（multi-target-directed ligands, MTDLs）策略已成为新药设计的有前景途径。其中，通过MTDLs开发的双重AChE/MAO-B抑制剂有望同时缓解症状并改变疾病进程。
多奈哌齐是一种强效、选择性的AChE抑制剂。其与人类AChE的共晶结构显示，其碱性叔胺部分占据AChE的催化活性位点（catalytic active site, CAS），而茚酮部分结合到外周阴离子位点（peripheral anionic site, PAS），形成双位点混合型抑制。沙芬酰胺是新批准的MAO-B抑制剂，其芳基苄基醚片段占据MAO-B的入口腔和底物腔，从而阻断底物接近黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅因子。
基于多奈哌齐和沙芬酰胺结构修饰的多样性（如多奈哌齐的茚酮和苄基哌啶基团可被替换，沙芬酰胺的芳基苄基醚片段关键而其酰胺侧链可被替换），本研究首先用沙芬酰胺的芳基苄基醚片段替换多奈哌齐的茚酮部分，预期该片段既能占据MAO-B的两个腔，又能通过π-π堆积和疏水相互作用与AChE的PAS结合。随后，为减小分子长度，将苄基哌啶基团进一步优化为烷基胺部分，得到一系列多奈哌齐-沙芬酰胺杂合物（图1）。为探索构效关系，系统地对连接链、取代位置和叔胺基团进行了修饰。
结果与讨论
化学合成
目标化合物通过不同的合成路线获得。化合物9a～c的合成如方案1所示，从3-羟基苯甲醛出发，经过醚化、还原、氯化、膦酸酯化、Horner-Wadsworth-Emmons反应、催化氢化和Boc脱保护得到关键中间体，最后与相应醛发生还原胺化得到目标物。化合物13～15和19～22的合成则以3-羟基或4-羟基苯甲酸为起始原料，经过醚化、酰氯化后与相应叔胺烷基醇酯化得到。目标酰胺化合物23～25通过中间体羧酸与相应叔胺烷基二胺的缩合反应合成。目标硫酯化合物28c的合成则先制备2-(吡咯烷-1-基)乙烷-1-硫醇，再与中间体羧酸缩合得到。
所有目标化合物均通过1H NMR、13C NMR和HR-MS表征，并经高效液相色谱（HPLC）测定纯度超过95.0%。
药理学评估
MAOs和ChEs抑制活性评估
所有杂合物对MAO-A的抑制均较弱，但对MAO-B表现出不同程度的抑制。其中，化合物20c显示出最强的MAO-B抑制活性（IC50= 0.0087 μM），约为沙芬酰胺的五倍。化合物28c也显示出相当的MAO-B抑制活性（IC50= 0.18 μM）。
构效关系（SAR）分析表明：将多奈哌齐的苄基哌啶药效团通过烷基或酯链连接到沙芬酰胺的芳基苄基醚部分，通常导致MAO-B抑制活性较弱；而将该药效团简化为更小的碱性叔胺部分后，MAO-B抑制活性显著增强；对位取代比间位取代更有利于MAO-B抑制；碳链长度从两个延长到三个或四个会降低MAO-B抑制效力；酯链连接比酰胺链连接更有利于与MAO-B的相互作用；引入哌啶基团不利于占据催化中心。
对MAO-B抑制活性较好（IC50< 10.0 μM）的化合物进行了胆碱酯酶（ChE）抑制活性测试。所有选择的杂合物均未显示出抑制丁酰胆碱酯酶（BuChE）的活性，但对AChE表现出不同程度的抑制。其中，28c显示出最强的AChE抑制活性（IC50= 1.70 μM）。
对于AChE抑制的构效关系：通过亚甲基连接两个药效团导致弱AChE抑制；在酯类化合物中，碳链长度从两个延长到三个或四个增加了AChE抑制效力（与MAO-B抑制趋势不一致）；引入吡咯烷基团有利于提高AChE抑制活性；硫酯链连接有利于抑制AChE。
MAO-B抑制机制评估
酶动力学分析表明，化合物28c对MAO-B的抑制表现为竞争性抑制模式，其竞争性抑制常数（Ki）为0.13 μM。透析实验证实，28c与沙芬酰胺一样，是可逆的MAO-B抑制剂。
分子对接结果显示，28c与MAO-B的结合模式与沙芬酰胺相似：其芳基苄基醚部分通过范德华力和疏水相互作用占据MAO-B的入口腔和底物腔，阻断底物接近FAD辅因子；其叔胺侧链也靠近FAD，占据酶的亲水区域，但与Cys172形成氢键。
分子动力学（MD）模拟评估了28c与MAO-B复合物的动态行为和稳定性。100 ns的模拟表明，配体、蛋白及复合物的均方根偏差（RMSD）、回转半径（Rg）等参数均趋于稳定，表明28c与MAO-B结合紧密且稳定。结合口袋内残基的均方根涨落（RMSF）值较低，表明配体周围灵活性降低。分子力学-泊松玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）方法计算结合能，结果显示范德华相互作用是结合能的主要贡献者，其次是疏水相互作用，静电效应提供额外稳定。计算得出的总结合能（ΔEMMPBSA）为-167.07 kJ/mol，表明28c与MAO-B有很强的结合亲和力。残基Ile199和Tyr398表现出最有利的结合能贡献，是相互作用的关键。
AChE抑制机制评估
酶动力学分析表明，化合物28c对AChE的抑制表现为混合型抑制模式，其Ki为1.71 μM。透析实验证实，28c与多奈哌齐一样，是可逆的AChE抑制剂。
分子对接研究显示，28c与AChE的结合模式与多奈哌齐相似：其叔胺侧链占据催化阴离子位点（CAS），通过范德华力和π-烷基相互作用与催化三联体（Ser203、Glu202、His447）结合；同时，其芳基苄基醚部分结合到外周阴离子位点（PAS），与Tyr337、Phe338和Tyr341形成π-π堆积。这种双位点结合模式与观察到的混合型抑制相关。此外，28c还通过范德华力、氢键、卤键（氟）、π-σ和π-硫相互作用与多个其他残基广泛结合。
MD模拟评估了28c与AChE复合物的动态行为。模拟轨迹显示，与28c/MAO-B复合物相比，28c/AChE复合物显示出更大的构象柔性。尽管如此，计算得出的总结合能（ΔEMMPBSA）为-151.81 kJ/mol。结合能分解同样显示范德华相互作用是主要贡献者。残基Trp286和Tyr341表现出最有利的结合能贡献。
血脑屏障渗透研究
通过ADMETlab和SwissADME平台预测，化合物28c符合Lipinski规则，并能穿透血脑屏障（BBB）。平行人工膜渗透性实验（PAMPA）进一步证实，28c的渗透系数（Pe）值为11.92 × 10–6cm/s，显著高于BBB渗透阈值（3.46 × 10–6cm/s），表明其能够穿透BBB。体内实验也证实，小鼠灌胃给药（50 mg/kg）10分钟后，脑组织中可检测到28c（12.8 ng/g），证明其具有体内BBB穿透能力。
稳定性研究
28c在小鼠血浆和脑匀浆中的稳定性通过HPLC评估。该化合物在血浆中发生水解，半衰期约为0.5小时；在脑匀浆中更稳定，半衰期约为2小时。考虑到其有效的BBB穿透能力，28c有望在脑内有足够时间发挥对AChE和MAO-B的抑制作用。
安全性研究
通过CCK-8法测定28c对PC-12细胞的细胞毒性，结果显示在浓度高达50.0 μM时，细胞活力和形态均未发生显著变化，表明在此浓度下无细胞毒性。急性毒性实验表明，C57BL/6J小鼠口服28c（1.0 g/kg）后，在14天的观察期内未出现异常行为或中毒症状，体重正常增长，无死亡。重要器官（脑、心、肝、脾、肺、肾）的组织病理学检查（H&E染色）未发现可辨别的病理变化，表明28c在高达1.0 g/kg的剂量下耐受性良好，无急性毒性迹象。
体内药效学研究
在Aβ1-42诱导的AD小鼠模型中评估了28c的体内抗AD疗效。在跳台被动回避实验中，Aβ1-42注射导致小鼠潜伏期显著缩短、错误次数增加，成功诱导了记忆和学习缺陷。灌胃给予多奈哌齐（5.0 mg/kg）或化合物28c（5.0 mg/kg）均能有效延长潜伏期、减少错误次数，表明两者均能改善Aβ1-42诱导的AD样症状，且28c在同等剂量下与多奈哌齐效果相似。
随后的免疫荧光分析进一步支持了这些发现。Aβ1-42注射导致海马神经元显著减少，表明海马体严重受损。与行为学结果一致，多奈哌齐和28c治疗均发挥了神经保护作用，保留了海马神经元密度。值得注意的是，在相同浓度下，28c的保护效果优于多奈哌齐。
结论
本研究设计并合成了一系列多奈哌齐-沙芬酰胺杂合物。通过系统优化，化合物28c被鉴定为AChE（IC50= 1.70 μM）和MAO-B（IC50= 0.18 μM）的有效双重抑制剂。机制研究表明，28c是可逆的AChE混合型抑制剂和MAO-B竞争性可逆抑制剂。分子对接和分子动力学模拟表明，28c主要通过范德华相互作用与MAO-B和AChE强效且稳定地结合。此外，28c表现出有效的血脑屏障穿透能力，在小鼠血浆和脑匀浆中具有合适的稳定性，并在体外和体内均显示出良好的安全性。体内评估进一步证明，28c能够减轻AD相关症状并发挥海马神经保护作用。这些发现凸显了28c作为进一步开发抗AD药物的极具前景的候选分子。
