环状胺基百里香酚氨基甲酸酯：一种高选择性强效人丁酰胆碱酯酶抑制剂，为阿尔茨海默病治疗开辟新路径

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Thymol carbamates bearing cyclic amines as potent and selective BuChE inhibitors alleviate memory impairments for Alzheimer’s disease therapy

本文介绍了一类新型百里香酚氨基甲酸酯化合物（TC系列），其中化合物TC-6展现出对人丁酰胆碱酯酶（hBuChE）纳摩尔级的抑制活性（IC50= 3.6 nM），以及对乙酰胆碱酯酶（hAChE）超过2500倍的选择性。该化合物具有拟不可逆抑制动力学、良好的血脑屏障通透性及神经保护作用，在Aβ1-42诱导的AD小鼠模型中显著改善认知功能、降低脑内Aβ水平并恢复海马神经元密度，为阿尔茨海默病（AD）治疗提供了极具潜力的候选药物。

　　

引言

痴呆症是一种与年龄相关的神经退行性疾病，阿尔茨海默病（AD）占所有病例的约60-80%。AD的特征是进行性的神经变性和认知功能下降。目前的治疗策略包括三种胆碱酯酶抑制剂（多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏）和一种NMDA受体拮抗剂（美金刚），以及两种单克隆抗体，但无法阻止或逆转疾病进程。

乙酰胆碱（ACh）信号传导的损伤与AD的典型特征（如认知缺陷和记忆衰退）密切相关。ACh主要由乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BuChE）水解。在AD晚期患者中，AChE水平显著降低，而BuChE水平不降反升，成为ACh水解的主导酶。因此，开发高选择性的BuChE抑制剂成为AD治疗的新策略。

百里香酚是一种天然酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌及抗Aβ活性。本研究设计、合成并评估了一系列新型的百里香酚氨基甲酸酯，旨在获得高效、选择性、可透过血脑屏障的BuChE抑制剂。

结果与讨论

化学合成

百里香酚氨基甲酸酯（TC-1至TC-12）的合成采用已发表的方法。在碱性条件下，三光气与伯胺或仲胺反应生成氨基甲酰氯中间体，随后百里香酚作为有效亲核试剂在碱性条件下反应，生成目标化合物。产物通过硅胶快速柱层析纯化，其结构经高分辨质谱（HRMS）、¹H和¹³C核磁共振（NMR）谱确认。TC-6的HPLC纯度为98.9%。

对AChE和BuChE活性的抑制

采用Ellman法评估了TC系列化合物对电鳗乙酰胆碱酯酶（EeAChE）和马丁酰胆碱酯酶（eqBuChE）的抑制活性。所有百里香酚氨基甲酸酯对BuChE均表现出高于AChE的选择性。其中，化合物TC-4、TC-6、H4和H5显示出纳摩尔级的抑制活性，IC₅₀值分别为13、3.6、47和12 nM。

结构活性关系（SAR）分析表明：

(i) 酚类核心（百里香酚 vs. 香芹酚）对BuChE抑制活性的影响：百里香酚总体优于或相当于香芹酚（例如TC-6活性强于H5）。

(ii) 胺取代基的影响：含有苄胺的百里香酚氨基甲酸酯仅具有微摩尔级活性；含有环状胺的化合物活性更优。

(iii) 环状胺环大小的影响：随着环尺寸增大，活性先降低（TC-4（氮杂环丁基）> TC-5（吡咯烷基））后增加（TC-5 < TC-6（哌啶基）），香芹酚氨基甲酸酯也观察到类似规律（H4 < H5）。

对人BuChE和人AChE的抑制

对合成化合物抑制人BuChE（hBuChE）和人AChE（hAChE）的活性评估显示，化合物TC-2、TC-4、TC-5、TC-6、H4和H5对hBuChE的IC₅₀值分别为2.67、0.013、0.14、0.0036、0.047和0.013 μM，均优于阳性对照多奈哌齐。其中，含有环状胺的TC-4、TC-5、TC-6、H4和H5被确定为高选择性hBuChE抑制剂，TC-6的活性最佳。

分子对接研究

为阐明百里香酚氨基甲酸酯与人BuChE的结合模式，将活性化合物对接到hBuChE的晶体结构（PDB: 1XLU和4BDS）中。对接结果表明，含有六元环（如哌啶）的化合物（如TC-6）比五元环化合物具有更有利的预测对接分数和更强的相互作用。在1XLU系统中，TC-6的苯环与Phe329、异丙基与Tyr332、哌啶环与Tyr82和His438形成氢键相互作用。在4BDS系统中，羰基氧和苯环与Arg465、异丙基与Phe21之间观察到氢键。

eqBuChE抑制动力学研究

研究了天然酚类氨基甲酸酯TC-5、TC-6和H5对马丁酰胆碱酯酶（eqBuChE）的拟不可逆抑制。拟不可逆抑制分为三个阶段：可逆的酶-抑制剂复合物（EC–I）形成（解离常数K_d）、氨基甲酰化（氨基甲酰化速率常数k₂）和脱氨基甲酰化（速率常数k₃）。TC-5、TC-6和H5表现出与利斯的明相似的拟不可逆抑制谱。尽管TC-6的K_d值与H5和TC-5相当，但其氨基甲酰化速率常数（k₂）显著更高，能够快速将可逆复合物转化为共价修饰的失活形式。同时，相对较慢的脱氨基甲酰化速率（k₃）表明氨基甲酰化酶在活性恢复前能持续更长时间。

细胞毒性评估

为评估合成化合物的体外细胞毒性，选择了GES-1胃黏膜上皮细胞。在50 μM浓度下暴露24小时后，TC-5、TC-6和H5处理的细胞活力基本不变（分别为97.0%、94.4%和90.3%），而多奈哌齐在相同浓度下使细胞活力降至86.4%。结果表明，TC-5、TC-6和H5对GES-1细胞的细胞毒性低于多奈哌齐。

PAMPA-BBB评估

采用PAMPA-BBB实验评估了化合物TC-4、TC-5、TC-6、H4和H5穿过血脑屏障（BBB）的能力。渗透系数（P_e）值超过4 × 10^–6cm/s的化合物被认为能够透过BBB。TC-4、TC-5、TC-6、H4和H5的P_e值分别为1.60、1.56、1.82、1.73和2.56 × 10^–5cm/s，表明这五种氨基甲酸酯均具有良好的血脑屏障通透性?4.0), moderate (2.0–4.0), or low (Pe?。

神经保护研究

在PC12细胞中评估了化合物TC-6对H₂O₂诱导的氧化损伤的保护作用。暴露于100 μM H₂O₂使细胞活力降至44.7%。TC-6表现出浓度依赖性的保护作用。在25 μM浓度下，TC-6将细胞活力显著提高至73.0%，与多奈哌齐处理组相当。结果表明，TC-6能有效保护PC12细胞免受H₂O₂诱导的氧化应激，显示出显著的神经保护作用。

TC-6在Aβ诱导的AD小鼠模型中的体内功效评估

通过侧脑室注射Aβ_1-42建立认知功能障碍模型，并使用莫里斯水迷宫（MWM）测试评估化合物TC-6对认知功能的影响。

实验结果表明，Aβ_1-42模型组小鼠的空间学习和记忆能力相对于对照组显著受损。多奈哌齐和TC-6处理组相对于模型组均有显著改善。值得注意的是，TC-6处理比多奈哌齐组表现出更短的逃避潜伏期、更多的平台穿越次数以及在目标象限更长的停留时间。

Aβ_1-42组小鼠脑室Aβ水平显著高于对照组和假手术组。TC-6（10 mg/kg）和多奈哌齐（15 mg/kg）处理显著减轻了Aβ_1-42诱导的认知障碍，使肽水平分别比模型组降低了14.2%和16.8%。

行为学研究结束后，对小鼠肝脏的组织病理学检查未发现明显的肝毒性迹象。

海马组织学检查

为进一步研究活性化合物TC-6如何减轻Aβ_1-42诱导的认知缺陷，取全脑进行海马CA1和CA3区的组织学检查。Aβ_1-42处理的小鼠在两个区域均表现出神经元密度显著降低，并伴有大量显示核固缩的退化神经元。定量分析表明，TC-6处理组神经元密度显著增加，尤其是在海马CA1区。

结论

本研究确立了百里香酚氨基甲酸酯作为一类新型强效、选择性BuChE抑制剂。TC-6对hBuChE表现出低纳摩尔级抑制（IC₅₀= 3.6 nM），对hAChE的选择性超过2500倍。SAR分析、分子对接和酶动力学研究揭示了其高效力和选择性的结构基础。TC-6具有拟不可逆抑制动力学（K_d= 0.25 μM, k₂= 0.98 min^-1）、良好的安全性、血脑屏障通透性和神经保护作用。在体内，TC-6显著减轻了Aβ_1-42诱导的小鼠认知缺陷并减少了海马神经变性。这些发现共同表明，TC-6是治疗阿尔茨海默病的一个有前途的先导化合物。