《mAbs》：Balancing the extremes for antibody developability: hydrophobic and electrostatic germline framework signatures for CDR-loop compensation
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本文综述了种系编码抗体框架区的静电与疏水表面特性如何调控抗体可变区（Fv）的可开发性。通过结构预测与表面斑块分析，作者系统比较了κ与λ轻链框架差异，鉴定出具有极端表面性质的种系，并利用疏水相互作用色谱（HIC）和肝素柱实验证实框架选择可补偿互补决定区（CDR）环路的物理化学特性。研究为通过理性选择种系框架来系统优化抗体可开发性提供了新见解与工具箱。
抗体药物是生物制药中快速增长的一类，但其潜在的可开发性问题（如聚集、清除和粘度）仍是持续关注的焦点。抗体可变区（Fv）由互补决定区（CDR）环路和框架区组成。CDR环路对抗原特异性至关重要且难以突变，而框架区则可以更换，以匹配由理化特性（如疏水性和静电性）主导的可开发性属性。本研究旨在系统分析种系编码抗体框架的静电和疏水表面特性，评估其在调节Fv可开发性中的作用，并提出通过理性选择框架来补偿CDR环路特性的新策略。
方法
研究始于四个亲本抗体，包括治疗性抗体贝利尤单抗和罗氏提供的三个专有抗体。通过WolfGuy注释方案（与IMGT注释方案的比较见补充信息表S1），使用ANARCI工具将Fv序列注释并划分为CDR环路和框架。基于国际免疫遗传学信息系统（IMGT）数据库，研究选择了120个重链V基因、51个λ轻链V基因和41个κ链V基因的框架序列，去除了框架区内相同的序列。随后，将每个重链框架序列与四个重链CDR环序列组合，同时将κ或λ轻链框架序列与对应的轻链CDR环序列组合，并添加固定的J基因序列，构建了大量Fv序列。使用ImmuneBuilder工具基于这些序列构建了结构模型。
为探究Fv的静电和疏水表面特性，研究使用了PEP-Patch工具。对于静电学，该程序以蛋白质数据库（PDB）格式的结构为输入，通过求解泊松-玻尔兹曼方程计算表面静电势，并定义正（+）、负（-）以及高（++）、低（--）表面斑块。总斑块积分描述了所有静电斑块的静电势积分。对于疏水性，采用了空间聚集倾向性（SAP）方法来计算疏水表面斑块，所有SAP得分的总和称为总疏水性，而仅正SAP得分的总和称为疏水评分。
研究还将Jain等人的数据集（包含137个处于临床II/III期或已获批抗体的12项可开发性检测数据）纳入分析，以验证计算。通过系统交换Jain数据集中抗体的重链框架、轻链框架和CDR环序列，构建了序列变体库，并建模计算了其表面斑块。实验验证部分，选取了来自Jain数据集的10组CDR环序列，将其移植到选定的极端种系框架上，表达Fab抗体片段，并测量了其在疏水相互作用色谱（HIC）柱和肝素柱上的保留时间。
结果
链型序列与CDR环序列的电荷分析
研究发现，κ轻链框架的净电荷范围在-5到+5之间，λ框架在-5到+4之间，中位数均为0，两者差异较小，无法直接通过电荷分离。重链框架则更偏向正电，范围在-2到+6之间，中位数为3。值得注意的是，不同CDR环序列间的电荷差异显著，例如两个λ CDR环序列（+6/-3和+7/-2）比两个κ CDR环序列（+3/-5和+4/-9）带有更多正电荷。这导致移植了λ CDR环的Fv集合其斑块积分分布整体向更正的值偏移，而移植了κ CDR环的集合则向更负的值偏移。
静电斑块的定位
通过分析斑块面积分布及其贡献残基，并利用Wasserstein距离比较相同轻链类型内不同CDR环集合的差异，研究发现CDR环残基会影响框架区斑块的面积分布。例如，轻链框架1（A链，位置501-504）的残基经常与CDR环残基共同参与形成斑块，导致其斑块面积分布在不同的CDR环集合间差异较大。相比之下，重链框架3（位置323-327）的斑块面积分布在相同轻链类型的不同集合间则非常相似，受CDR环影响较小。
比较κ和λ轻链集合发现，λ轻链中每个残基的负电斑块中位面积比重链和κ轻链中的更大。κ轻链的正电斑块在界面区（由框架2构成，位置601-616，C链，CC‘环，C’链）以及界面边缘（框架3的C‘D环，位置701-705）尤为突出。此外，除框架2外，κ轻链中参与带电斑块的残基比例较小，而重链和λ轻链中有更多残基参与形成面积更大的带电斑块。
保守氨基酸类型的空间邻近性
对保守氨基酸类型（定义为出现频率>70%）的空间邻近性分析，揭示了κ和λ轻链之间的关键差异。在λ轻链中，EF环和F链（位置727、728、729、731）存在一组保守的酸性残基，它们朝向界面，有助于形成负电表面斑块，且很少形成盐桥（例如位置731仅在2%的结构中形成盐桥），因此其负电荷未被中和。
而在κ轻链中，除了与λ轻链共有的两个保守碱性残基位点（位置705和806）外，在AB环（位置518）、CC‘环（位置605）、C’链（位置611）和G链（位置810）还有额外的保守碱性位点。其中，位置605和611位于界面区，它们的正电荷在λ轻链中是缺失的，且尽管附近存在酸性残基，它们也并未完全通过盐桥被中和（在κ框架结构中，这些位置形成盐桥的比例在18%到60%之间）。这使得κ轻链的界面（主要由框架2构成）比λ轻链的界面带有更正的电性。然而，κ轻链中界面外的碱性残基（如518、806、810）通常与酸性残基通过相互作用或空间邻近被直接中和，导致Fv表面净电荷呈中性。
异常种系家族与异常种系
研究通过分析各种系家族的斑块积分和疏水评分分布，并识别超出1.5倍四分位距的异常值，鉴定出了一系列具有极端表面性质的“异常种系”。总体而言，更多异常配对表现为更负电和更疏水，而更正电的异常仅出现在κ轻链中。只有两个种系（IGKV6-21和IGKV6D-21）的Fv总疏水性显著更亲水。
研究进一步分析了导致异常表面性质的关键残基突变。例如，重链家族4中的IGHV4-34和IGHV4-59因在位置107将常见的极性丝氨酸（95%）或苏氨酸（1%）替换为疏水性色氨酸，而表现为更疏水。重链家族1中的IGHV1-69-2 * 01和IGHV1-69 * 03则通过将保守碱性残基变为极性残基或引入酸性残基，表现为更负电。κ轻链家族1中的IGKV1-17因在位置612将保守的亮氨酸替换为精氨酸，而贡献了更正的表面性质。家族1D的种系（如IGKV1D-8）则通过将极性或酸性残基替换为疏水残基，同时表现出更正电和更疏水。λ轻链家族3和8的种系（如IGLV3-10和IGLV8-61）则通过引入额外的酸性残基或将碱性残基变为极性残基，表现出更负电。
CDR环与框架对Fv表面特性的影响
将Jain数据集纳入分析后，研究发现Fv的正电斑块积分（‘+’）与肝素柱相对保留时间相关性最佳（R2= 0.65），而疏水评分与HIC保留时间相关性最佳（R2= 0.29，Spearman等级相关系数为0.54）。虽然CDR环的平均斑块积分与检测数据的相关性最强，但框架区的影响不容忽视。
通过线性回归模型预测Fv的斑块积分和疏水评分，发现重链框架、轻链框架和CDR环三者的平均贡献近似加和，且贡献权重较为平衡（对于正电斑块，权重系数分别为0.98, 1.07, 0.99；对于疏水评分，权重系数分别为0.82, 0.71, 0.88），模型决定系数R2分别达到0.96和0.81。这证明了三者共同决定了Fv的最终表面性质。
研究还提供了框架补偿CDR环特性的实例。例如，虽然甘特努单抗的CDR环比布雷金单抗的带有更多正电荷，但两者的肝素保留时间和Fv正电斑块积分值相似，这是因为布雷金单抗采用了更正电的框架来补偿其CDR环相对较少的正电荷。同样，虽然西卢库单抗的CDR环比乌瑞鲁单抗的疏水性强得多，但两者HIC保留时间和疏水评分相近，这是因为西卢库单抗采用了疏水性更弱的框架进行了补偿。
通过交换框架改变Fv特性
最后，研究测试了通过选择极端种系框架来主动改变（补偿）Jain抗体Fv表面性质的假设。根据鉴定的异常种系，选择了能够将性质向更负电、更正电、更疏水或更亲水方向“偏移”的框架组合，并将它们与来自Jain数据集的10组CDR环进行移植。
计算和实验结果表明，选择的框架能够有效地将Fv的表面性质（正电斑块积分和疏水评分）向预期方向偏移。框架的“极端”程度越高，产生的偏移越大。对于静电性质，当两个框架链均为“强负电”或“强正电”时，产生的负向或正向偏移最为显著。对于疏水性质，成功地将Fv向更疏水方向偏移，但向更亲水方向的偏移则更具挑战性。不过，对于除非利珠单抗（fletikumab，其原始框架已非常亲水）外的所有Jain Fv，都至少找到了一种框架组合能成功增加其预测的亲水性。
实验测量的HIC和肝素柱保留时间的偏移，与计算预测的表面性质偏移高度一致，验证了PEP-Patch计算的可靠性以及通过框架选择补偿CDR环特性的可行性。
讨论
本研究的主要发现包括：λ和κ轻链框架区存在显著差异，λ框架具有更大的负电表面斑块，而κ框架拥有一个正电界面；鉴定出了能显著改变表面性质的特定种系编码位置及“异常种系”；并证明这些异常种系可用于补偿CDR环的表面性质。
尽管CDR环对Fv整体表面性质有重大影响，但线性回归模型和移植实验均证明框架区能够改变整体性质。这与先前通过同种型转换或更换框架来改善抗体溶解度的研究相呼应。与传统点突变优化相比，更换框架还能降低引入免疫原性的风险。
实验与计算结果的高度一致，证明PEP-Patch能够准确描述框架的表面效应，且保留时间的偏移可通过斑块数据偏移进行预测。这意味着研究成功识别了具有极端表面性质的种系框架，并为其在抗体设计中的应用找到了实际途径。
当然，挑战依然存在。疏水性预测对结构构象更为敏感，短时模拟可能提高其预测准确性。增加亲水性比增加疏水性更困难，且疏水斑块（尤其与CDR环重叠时）更难被补偿。此外，本研究未考虑构象或热稳定性，也未涉及为保持抗原结合亲和力而常需进行的回复突变。但本方法已识别出对表面性质有关键影响的残基位点，回复突变可被纳入考量。
总之，本研究首次在框架层面系统比较了κ与λ轻链，并系统描述了种系框架的理化性质。通过利用种系编码框架的固有特性，研究展示了一种不改变CDR环即可调节抗体表面性质（如静电性和疏水性）的系统方法，为优化抗体可开发性提供了新的工具箱和更结构化的工程策略。
