Xevinapant代谢新发现：氧化代谢物oxMET1的鉴定、结构解析与非临床特征解析

《Xenobiotica》：Identification, structural elucidation and nonclinical characterization of oxMET1: A further major metabolite of xevinapant?

本文鉴定了口服凋亡蛋白抑制剂（IAP inhibitor）xevinapant在人体循环中的一种新型重要代谢物（oxMET1），其占单次给药后总药物暴露的近10%。作者综合利用高分辨质谱（HRMS）和核磁共振（NMR）完成了oxMET1的精确结构解析，明确了其在吡咯并二氮杂环第4位点的S构型羟基化修饰。后续非临床表征显示，oxMET1对靶点cIAP1的抑制活性可忽略不计，且在用于安全评价的动物种属（犬）中其暴露量可覆盖人体预测稳态暴露水平。因此，尽管oxMET1是人体重要代谢物，其预期无临床药效学贡献，且不构成不成比例的代谢物安全风险，但仍需进一步评估其药物-药物相互作用（DDI）潜力。此研究展示了代谢物鉴定与表征在药物开发中的关键作用。

　　

1. 引言：Xevinapant的背景与新代谢物的发现

Xevinapant是一种口服的小分子抑制剂，靶向凋亡蛋白抑制剂（IAPs），IAPs是调控细胞死亡与存活的关键蛋白，在多种肿瘤细胞中过表达，如头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）。然而，在随机III期TrilynX研究中，xevinapant联合标准放化疗（CRT）相较于单独CRT未显示改善的疗效，导致该药物开发计划终止。

在临床药理学开发进程中，一项人体质量平衡研究（NCT04962724）旨在识别和表征潜在的主要人体代谢物。在这项研究中，一种名为“氧化D-1143-MET1”（M493或oxMET1）的新代谢物被发现，并因其占单次给药后总药物相关暴露的近10%（即接近“主要代谢物”标准）而被认为具有进一步结构鉴定与表征的价值。oxMET1是已知代谢物D-1143-MET1（M477或MET1）的直接下游氧化产物，此前在非临床及临床研究中均未被检测到，因此成为本研究的焦点。

2. 材料与方法：多技术联用攻克结构解析难题

为获得足量oxMET1进行结构鉴定，研究团队建立了一套集成的技术流程。首先，利用狗肝微粒体孵育其前体MET1来生成oxMET1，通过液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）初步分析了其质谱行为。研究发现oxMET1在电离过程中极易发生水丢失（-18 Da，即原位碎裂），这可能是其早期研究中被遗漏的原因。由于其质谱碎片信息不足以确定氧化位点，研究人员进行了半制备规模的色谱分离，从复杂的孵育体系中纯化出oxMET1。

获得纯品后，研究的关键一步是利用核磁共振（NMR）光谱进行确定性的结构解析。通过获取并分析oxMET1及其前体MET1的一维¹H和二维（COSY， HSQC， HMBC， ROESY）NMR谱图，成功实现了全谱峰归属。对比MET1与oxMET1的HSQC谱图，发现MET1分子中第4位的一个亚甲基（CH₂）信号在oxMET1中转变为一个次甲基（CH）信号，且该碳原子的化学位移为83.62 ppm，氢原子化学位移为4.70 ppm，这些特征均明确指向一个N,O-缩醛结构，从而精确定位了羟基氧化发生在吡咯并二氮杂环骨架的第4位碳原子上。

然而，NMR未能直接确定新生羟基的手性中心（R或S构型）。为此，研究人员采用了一种先进的计算机模拟方法。他们从实验测得的H-4与H-3原子之间的偶合常数（³J_HH= 8.6 Hz）入手，通过量子化学计算（使用GFN-xTB， DFT等方法）模拟了R和S两种构型异构体的可能构象及其理论偶合常数。计算结果显示，S构型的理论平均偶合常数（8.15 Hz）更接近实验观测值（8.6 Hz），而R构型的预测值仅为1.60 Hz。这一强有力的计算证据结合后续由微生物孵育合成的标准品ROESY谱图佐证，最终确定oxMET1中羟基取代的碳原子为S构型。为了最终确认所研究代谢物与目标物的一致性，还将从人体血浆样品中检出的oxMET1与微生物合成的S构型标准品进行了共色谱分析，二者色谱行为与质谱图完全一致。

3. 结果：OxMET1的初始非临床特征

在明确了oxMET1的精确化学结构后，研究团队对其进行了初步的非临床药理与安全性表征。

首先是药效学评估。在MDA-MB-231细胞中检测了xevinapant及其代谢物MET1、oxMET1诱导靶蛋白cIAP1降解的能力（一种衡量靶标结合的药效学生物标志物）。结果显示，xevinapant能有效降解cIAP1，IC₅₀值为14.5 nM。与之形成鲜明对比的是，MET1和oxMET1在最高测试浓度（30 μM）下仅轻微降低cIAP1水平，其IC₅₀估值分别大于10 μM和8.0 μM 。考虑到oxMET1在人体血浆中的游离分数（f_u）很低，约2%（xevinapant约为15%），其在体内的药理活性贡献被认为是可以忽略不计的。

其次是安全性相关的种属覆盖度评估。通过LC-MS/MS方法定量分析了在大鼠和犬的13周重复给药毒性研究血浆样本中的xevinapant、MET1和oxMET1浓度。数据显示，oxMET1在这两种用于安全性评价的动物种属中均存在，且其在犬中的暴露量与人体预测暴露量处于同一数量级，表明至少有一种安全评价种属（犬）充分覆盖了该人体代谢物。

此外，研究还进行了简单的药代动力学（PK）建模，以预测在每日一次重复给药（稳态）条件下oxMET1的暴露情况。基于单次给药人体质量平衡数据，模型预测oxMET1在稳态时的暴露可能达到总药物相关暴露的约11%，超过了监管指南中通常关注的10%阈值。

4. 讨论与结论：研究意义与未来方向

本研究系统性地完成了一种新型重要人体代谢物oxMET1从发现到全面表征的完整工作流。oxMET1是xevinapant代谢通路中的一个下游氧化产物，其S构型羟基化发生在吡咯并二氮杂环的第4位碳上 。

综合所有数据，可以得出几个关键结论：第一，oxMET1缺乏显著的体外药理活性，因此预期其对xevinapant的体内疗效没有贡献。第二，在用于非临床安全性评价的犬中，oxMET1的暴露量充分覆盖了人体（包括预测的稳态）暴露水平，因此根据代谢物安全性评价（MIST）指南，oxMET1不构成“不成比例的代谢物”，未引发特殊的安全担忧。

然而，研究也指出了下一步的工作方向。由于模型预测oxMET1在稳态下可能成为超过10%总暴露的主要代谢物，根据现行的药物-药物相互作用（DDI）指南（如ICH M12），需要进一步评估其作为“ perpetrator”（ perpetrator）的潜力，即考察其是否可能抑制或诱导肝脏药物代谢酶（如CYP450）或药物转运体，这一评估需要综合考虑xevinapant及其前体MET1的联合效应。

总之，本案例凸显了在药物开发中对循环代谢物进行及时、深入表征的重要性。它不仅确保了对其潜在药效和安全风险的全面理解，也为后续的临床开发策略（如DDI研究设计）提供了关键的科学依据。这项集成的工作流程——结合了先进的质谱、核磁共振、计算化学和体外生物学实验——为未来类似代谢物的研究提供了有价值的范本。