《Infection and Drug Resistance》：Performance Evaluation of Targeted Nanopore Sequencing in Non-Tuberculous Mycobacteria Identification: A Comparative Study in Shenzhen, China
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本研究系统评估了靶向纳米孔测序（tNS）在非结核分枝杆菌（NTM）菌种鉴定中的应用价值，并与传统Sanger测序及宏基因组测序（mNGS）进行比较。结果显示，在深圳地区收集的50株疑似NTM临床分离株中，tNS展现出最高的鉴定准确性与一致性（F1值为0.927），可作为临床辅助鉴定的优选方案。其鉴定结果与mNGS联用可获最佳验证，为NTM感染的快速精准诊断提供了有力的技术支撑。
引言
非结核分枝杆菌（NTM）是除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌外的一大类分枝杆菌，已鉴定超过190种。它们是重要的机会性病原体，可感染肺部、软组织和淋巴结等，其肺部感染症状常与肺结核相似。全球范围内，NTM感染率和相关疾病发病率呈上升趋势，尤其是在免疫低下人群、结构性肺病患者、老年人和长期吸烟者中。中国的NTM分离率在过去几十年显著攀升，且存在明显的地理异质性，以东北和东南沿海地区较高。深圳等南方沿海城市由于气候温暖潮湿、人口流动性大，NTM感染风险较高，其中鸟分枝杆菌复合群（MAC）和脓肿分枝杆菌复合群（MAB）是主要致病菌。鉴于NTM感染治疗复杂、费用高昂，提高其鉴别诊断准确性至关重要，而菌种鉴定是其中的基础环节。传统的鉴定方法耗时费力，现代测序技术（包括二代和三代测序）为NTM菌种鉴定带来了新机遇。靶向纳米孔测序（tNS）结合了靶向扩增和纳米孔测序的优势，具有快速、高灵敏度和高特异性的特点。
材料与方法
本研究回顾性收集了2024年12月至2025年6月期间，从中国深圳10个区的耐药结核病监测中分离的50株疑似NTM菌株。菌株初步鉴定采用荧光PCR探针熔解曲线分析法。从所有菌株中提取基因组DNA，并分别使用靶向纳米孔测序（tNS）、宏基因组测序（mNGS）和Sanger测序进行菌种鉴定。
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样品制备：在罗氏固体培养基上培养样本，提取DNA。
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靶向纳米孔测序：使用R9分枝杆菌鉴定和抗菌素耐药性检测试剂盒，靶向扩增hsp65基因片段，在GridION平台测序，使用Nano TNGS V1.0分析平台进行数据分析。
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宏基因组测序：构建文库后在Illumina NovaSeq 6000平台进行高通量测序，使用Kraken2和NTM-profiler（基于ANI算法）进行物种鉴定。
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Sanger测序：扩增16S rRNA基因，送测序后比对NTM-DB数据库确认菌种。
使用Jaccard相似性指数、分类一致性Kappa系数和模型性能F1值等统计指标，评估三种测序方法的一致性以及tNS在NTM菌种鉴定中的检测性能。
结果
三种测序方法鉴定的主要实验菌种分布
在分析的50份样本中，除1份样本因核酸质量不佳未能进行Sanger测序外，其余均成功测序。三种测序方法检出频率最高的菌种均为脓肿分枝杆菌和偶然分枝杆菌，二者均为快速生长型NTM。值得注意的是，tNS在4份NTM初筛样本中检出了结核分枝杆菌，而mNGS在12份NTM初筛样本中检出了结核分枝杆菌。
三种测序方法鉴定NTM菌种的一致性分析
在50份疑似NTM样本中，三种测序方法（tNS、mNGS和Sanger测序）在全部菌种鉴定结果上完全一致的样本有18份（36%）。tNS与mNGS之间的一致性最高，两者在28份样本（56%）中给出了相同的菌种鉴定结果。对于结果不一致的NTM样本，高通量测序方法（tNS和mNGS）在菌种鉴定上表现出更好的可重复性。相比之下，Sanger测序因混合样本导致的重叠峰问题，未能准确鉴定13份样本（26%）。在混合菌种NTM样本中，tNS鉴定出9份，mNGS鉴定出14份，差异无统计学意义。
由于样本中低丰度、多样性的NTM菌种的临床意义不确定，研究进一步比较了样本中主要NTM菌种的鉴定结果。分析显示，28份样本（56%）在主要菌种鉴定上三种方法结果一致，一致性高于全菌种分析。tNS和mNGS在46份样本（92%）上结果一致，表明高通量测序方法在鉴定主要NTM菌种方面具有高度一致性。
三种测序方法在NTM菌种鉴定中的性能分析
通过对测序结果进行综合评估，确立了50株疑似菌株的最终物种鉴定参考结果。总体而言，tNS在所有评估指标（精确度、召回率、F1值和Jaccard系数）上均表现出最优性能。其全菌种鉴定的精确度为0.937，略低于mNGS（0.950），但在其余指标上表现更优。Sanger测序在整个研究中未能鉴定混合菌种，且易受混合菌种导致的重叠峰影响而鉴定失败，因此在NTM菌种鉴定中表现欠佳。mNGS的整体性能略逊于tNS，主要归因于其分析算法相关的检测灵敏度问题。
此外，研究进一步分析了三种测序方法对主要细菌菌种（共9种NTM）的灵敏度、特异度、准确度（ACC）和Kappa值。在检出频率相对较高的三种细菌（脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌和结核分枝杆菌）中，检测性能存在显著差异。对于脓肿分枝杆菌，三种检测方法均表现出较高的鉴定一致性；对于偶然分枝杆菌，tNS和mNGS均达到100%的灵敏度、特异度和ACC；对于结核分枝杆菌，三种检测方法的鉴定一致性均较差。
讨论
中国NTM的分布具有显著的地理异质性。本研究纳入的50株疑似NTM分离株（包括26种已知菌种和24株未分类菌株）用于方法学评估，样本构成有效评估了三种测序技术的鉴别能力。
本研究显示，三种测序方法在全部菌种鉴定上的总体一致性相对一般，但tNS在各项评价指标上均表现最优。这些结果主要归因于三种测序方法在检测原理和分析算法上的固有差异。Sanger测序作为传统的一代测序技术，仅限于对单个基因片段（本研究为16S rRNA基因）进行测序，极易受到重叠峰干扰，在鉴定混合菌种和低丰度微生物方面效果有限。mNGS作为二代高通量测序技术，对样本中全部基因组进行非靶向测序，其分析易受测序深度、序列比对算法和序列比例权重参数的影响。tNS作为整合了三代纳米孔测序与靶向扩增的技术，仅针对hsp65基因（NTM菌种鉴定的主要鉴别位点）进行靶向扩增和测序，其分析算法仅依赖序列比例作为菌种判定标准，虽然增强了特异性，但忽略了序列一致性的考量，且纳米孔测序固有的单读长准确性较低可能易导致基因片段比对错误。
此外，本研究还发现tNS和mNGS在鉴定结核分枝杆菌时一致性较差，主要原因是两者鉴定标准不同以及tNS单读长准确性较低、依赖单基因片段进行菌株鉴定，增加了比对错误的易感性。相比之下，对于另外两种检出频率较高的NTM菌种，二代和三代测序方法鉴定结果的Kappa值均超过0.86，表明这些测序方法在鉴定常见NTM菌种方面具有较高的准确性。
本研究存在一些局限性：样本来源局限于与耐药结核病相关的人群，未涵盖其他NTM感染高危人群；样本量相对有限；所有分析均使用纯培养物而非直接临床标本；且本研究仅专注于菌种鉴定，未分析三种测序方法检测NTM耐药基因的效果。
结论
总之，靶向纳米孔测序（tNS）是中国深圳地区临床鉴定NTM分离株的优选辅助方法，其鉴定结果与宏基因组测序（mNGS）结果整合可获得最佳验证。本研究为应用tNS技术进行NTM菌种鉴定提供了有力支持。
