藻胆蛋白（Phycobiliproteins，简称PBPs）是一类水溶性蛋白质化合物，是单细胞红藻、蓝细菌、绿藻和隐藻中的辅助光合色素[1]。根据其结构和藻胆素类型的不同，PBPs具有不同的光吸收特性，常见的分类包括：藻红蛋白（Phycoerythrins，λmax 540–570 nm）、藻蓝蛋白（Phycocyanins，λmax 610–620 nm）、异藻蓝蛋白（Allophycocyanins，λmax 650–655 nm）和藻红藻蓝蛋白（Phycoerythrocyanins，λmax 570–600 nm）[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。藻红蛋白仅存在于红藻和蓝细菌中[6]。从结构上看，藻红蛋白由α和β多肽链通过共价键与四吡咯衍生物（bilins）结合而成。与其他PBPs相比，藻红蛋白每个单体包含最多的bilins（通常为五个），主要包括藻红胆素（Phycoerythrobilin，PEB）和藻蓝胆素（Phycourobilin，PUB）[8]。这些特性使得藻红蛋白具有更高的摩尔消光系数和荧光量子产率。此外，藻红蛋白还具有抗氧化、抗病毒、抗癌、抗炎和神经保护作用，使其成为与人类健康、食品、制药、化妆品、营养保健品和生物医学相关的应用中的有前景的原材料[9]、[10]、[11]、[12]。
在产生藻红蛋白的生物中，单细胞红藻Porphyridium属物种因其卓越的藻红蛋白积累能力而尤为突出。其在受控培养条件下的可扩展性和强大的生物量生产潜力使其适合大规模生物加工。此外，该物种还能产生高价值的代谢物，如硫酸化多糖、多不饱和脂肪酸和其他生物活性化合物，从而支持集成生物精炼技术，提高工艺的可持续性和经济可行性[13]、[14]、[15]。
PBPs（包括藻红蛋白）可以通过多种提取技术获得，常用的提取溶剂包括磷酸盐缓冲液[16]、Tris-Cl[18]或醋酸盐[19]，以及NaCl[21]等盐溶液[21]、[22]。近年来，一些环保型溶剂，如离子液体（ILs）和深共晶溶剂也逐渐被应用，提高了PBPs的提取效率和选择性[23]、[24]、[25]。尽管提取方法和溶剂变得越来越高效和选择性，但为了达到大多数工业应用所需的纯度和质量标准，仍需要后续的纯化步骤[26]、[27]、[28]。
通常，高纯度PBPs的生产需要多个纯化步骤，这些步骤成本较高且可能导致产率损失，从经济角度来看并不可行[19]、[29]、[30]。这些步骤包括先用硫酸铵进行初步纯化处理，随后通过膜分离技术（如透析[18]、[27]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]）和超滤[30]、[40]、[41]去除高浓度盐分，再利用色谱技术（主要是离子交换色谱[IEX][27]、[31]、[32]、[34]、[37]、[39]、[42]、[43]和疏水相互作用色谱[HIC][18]、[21]、[34]、[35]、[44]、[45]进行进一步纯化。
对于藻红蛋白的纯化，最常用的色谱方法是离子交换色谱（IEX，参见[31]、[39]）。然而，IEX不适用于初始盐浓度较高的样品，因为盐离子会与蛋白质竞争柱子上的离子结合位点，导致蛋白质过早洗脱[46]。因此，必须通过透析、膜过滤、脱盐色谱或稀释等方法对样品进行预处理以去除盐分。在这种情况下，应考虑使用疏水相互作用色谱（HIC）等其他纯化技术来处理高盐浓度样品。
HIC是一种基于吸附的纯化技术，根据蛋白质和核酸的表面疏水性进行分离和纯化。该技术也被用于PBPs的纯化，但纯度和产率的结果各不相同[18]、[35]、[38]、[44]、[45]、[47]、[48]（见表1）。
HIC利用蛋白质与HIC树脂中的疏水配体之间的可逆相互作用进行分离。虽然PBPs主要是亲水性的，但它们也具有特定的疏水区域，这些区域对其结构、稳定性和生物功能至关重要[49]、[50]。PBPs表面的疏水区域通常分布在α和β亚基的交界处[50]。
在高盐浓度下，疏水性较强的蛋白质会与配体结合得更牢固，而疏水性较弱的蛋白质则结合较弱或直接通过柱子未被保留。为了洗脱吸附的蛋白质，需要逐渐降低盐浓度，从而减弱疏水相互作用，使蛋白质按疏水性顺序脱附[51]、[52]。因此，盐的类型和浓度在HIC中起着关键作用：高盐浓度有利于蛋白质表面与固定相疏水配体之间的相互作用，而低盐浓度则会减弱这种作用。此外，所使用的盐类型（通常是硫酸铵）对蛋白质的保留和分离选择性也有显著影响，因为不同盐类的亲水性质不同，有些盐具有促进蛋白质保留的作用（称为亲水盐），而有些则具有相反的效果（称为疏水盐）[51]、[52]、[53]。
HIC树脂在蛋白质分离中起着重要作用。树脂由硅胶、合成共聚物或亲水性碳水化合物（如琼脂糖）构成，疏水配体通过间隔臂连接到树脂上。琼脂糖由D-半乳糖和3,6-无水-L-半乳糖通过α和β键连接而成，由于其高度亲水性、良好的机械性能、低非特异性结合能力、高孔隙率和较高的配体承载能力，成为最常用的树脂之一[54]。
虽然树脂的孔径和颗粒大小等特性直接影响柱子的容量、吸附和脱附动力学以及色谱分辨率[55]，但疏水配体才是决定蛋白质吸附行为的主要因素。直链烷基配体通常具有疏水性，而芳基配体则表现出芳香性和疏水性的混合作用。高度疏水的配体（如含有长链烷基或苯基的配体）能与蛋白质紧密结合，有助于分离高度亲水的蛋白质；而含有丁基、乙基、甲基和羟基等基团的配体则适用于中等或高度疏水性的蛋白质[51]、[56]。配体的取代程度指的是HIC基质中被疏水配体修饰的活性位点数量，而配体密度则反映了可与蛋白质结合的疏水配体数量。配体密度受取代程度、用于连接配体和基质的间隔臂的长度和灵活性、蛋白质的大小和形状以及基质孔径的影响[57]、[58]。通常，蛋白质-配体结合位点越多，结合强度越高，但也需要更强的洗脱条件[57]。间隔臂的长度和灵活性也会影响配体与蛋白质的结合能力和选择性。例如，较长且更灵活的间隔臂有助于配体更好地与蛋白质的疏水区域结合[59]。
与其他色谱技术相比，HIC在去除不需要的蛋白质变体、错误折叠的蛋白质形式和某些杂质（如疏水聚集体）方面具有优势。它还能根据蛋白质的疏水性特征高效分离电荷或大小相似的蛋白质，并且纯化条件温和，能够保持蛋白质的稳定性和功能性。然而，HIC需要优化操作条件，且与某些洗涤剂的兼容性有限。此外，该过程通常需要高盐浓度来建立足够的疏水相互作用，这会增加生产和处理成本[51]、[52]、[60]。
本研究提出了一种使用HIC制备分析级藻红蛋白的新一步纯化方法。创新之处在于利用了基于离子液体的粗提物，尽管这种提物由于盐浓度高和离子强度强而可能存在问题，但本研究利用这些特性提供了启动HIC过程所需的离子强度。因此，该方法有效减少了纯化步骤，无需预先脱盐即可直接处理富含藻红蛋白的提取物。同时，研究了六种不同类型的疏水树脂的性能，这些树脂具有不同的配体、配体取代程度和琼脂糖基质特性。这项研究为了解使用不同疏水树脂纯化藻红蛋白的行为提供了宝贵见解，有助于根据所需的纯度和产率目标选择最合适的树脂。
