用于pH控制蛋白质富集和临床生物标志物检测的氧化石墨烯掺杂整体材料的绿色制备方法

《Analytica Chimica Acta》：Green preparation of graphene oxide- incorporated monoliths for pH-controlled protein enrichment and clinical biomarker detection

选择性富集低丰度蛋白质的毛细管柱开发及pH调控机制研究。通过整合石墨烯氧化物（GO）与绿色深共熔溶剂（DESs）和离子液体（ILs）二元孔生成体系，构建了PAS-GO-poly(BMA-co-EDMA)毛细管吸附材料。该材料利用pH响应性实现基于等电点（pI）的特异性蛋白吸附，对牛血清白蛋白（BSA）的吸附容量达26.13 mg/g，富集因子61.32，重复性RSD≤1.08%。在HeLa细胞裂解液和SCLC患者血浆中成功实现神经元特异性烯醇化酶的高效分离，环境性能评估得分＞92。

　　

Xue Zhang|Fenghua Xu|Rui Wu|Huiying Zhang|Yufei Shi|Zhaosheng Liu|Xin Dong

上海大学医学院，中国上海200444

摘要

背景

特定蛋白质的富集对于生物标志物的发现、机制研究以及诊断和治疗策略的开发至关重要。在血浆和细胞裂解物等复杂的生物基质中，目标蛋白质通常以微量存在，相对于丰富的背景蛋白质而言，导致信噪比较低，分析灵敏度受损。尽管基于亲和力的富集方法具有高特异性，但它们通常依赖于对蛋白质表位或配体的先验知识。因此，高效富集特征不明显的蛋白质仍然是一个重要的分析挑战，本研究旨在解决这一问题。

结果

为了克服这一限制，我们使用由深共晶溶剂（DESs）和离子液体（ILs）组成的绿色二元孔隙生成系统制备了一种改性的氧化石墨烯（GO）掺杂单体PAS-GO-poly(BMA-co-EDMA)单体。该单体通过pH控制相互作用实现了选择性蛋白质富集。使用改进的GAPI方法对其环境性能进行评估，结果显示其可持续性优异，得分超过92。PAS-GO-poly(BMA-co-EDMA)单体对牛血清白蛋白的吸附能力高达26.13 mg/g，富集因子为61.32，且重复性良好（RSD ≤ 1.08%）。Langmuir等温线分析显示最大吸附能力增加了55.7%（R2 = 0.9629）。与不含GO的单体相比，含有GO的单体在HeLa细胞裂解物中使等电点接近加载pH值的蛋白质比例增加了10%以上，并成功用于从小细胞肺癌患者血浆中选择性富集神经元特异性烯醇酶。

意义

本研究提出了一种基于pH控制的绿色PAS-GO-poly(BMA-co-EDMA)单体，能够选择性富集蛋白质，从而规避了传统基于亲和力方法的关键限制。通过结合高吸附能力、稳健性和环境可持续性，该平台增强了复杂生物样本中低丰度蛋白质的富集效果，并通过有效分离患者血浆中的神经元特异性烯醇酶证明了其临床相关性。

引言

在蛋白质组学中，目标蛋白质的选择性富集对于生物标志物的鉴定、疾病机制的阐明以及诊断和治疗策略的开发至关重要[1]、[2]、[3]。这些技术能够表征蛋白质的活化状态、相互作用网络和信号通路中的动态调控，为分子疾病机制提供关键见解[4]。然而，在血浆或细胞裂解物等复杂样本中，目标蛋白质通常以微量存在，相对于背景蛋白质而言，导致信噪比较低，给下游的鉴定和定量带来挑战。传统方法（包括亲和层析）依赖于已知的表位或配体，限制了它们对未知或特征不明显的蛋白质的适用性，而免疫沉淀或电泳可能会引入额外的步骤，导致蛋白质变性或丢失[5]、[6]、[7]、[8]。基于毛细管单体的蛋白质富集策略具有高表面积、可调孔隙率和高效的质量传递，能够快速选择性地捕获目标蛋白质[9]、[10]、[11]。它们的连续原位格式减少了样本损失和处理步骤，提高了重复性。这些特点使它们特别适合处理复杂生物基质中的低丰度蛋白质。

氧化石墨烯（GO）是一种二维碳材料，富含含氧功能基团，包括羧基、羟基和环氧基团[12]、[13]、[14]、[15]。其高导电性、大的比表面积和量子尺寸效应使GO在生物传感和吸附应用中具有显著优势[16]、[17]。这些功能基团不仅赋予GO良好的亲水性，还为蛋白质表面的氨基酸残基提供了丰富的相互作用位点，包括静电相互作用、氢键、π-π堆叠和疏水相互作用[18]、[19]。通过控制氧化程度和层厚度，GO可以被功能化以适应高性能生物分离介质[20]、[21]、[22]、[23]。例如，Cemil Aydo?an等人开发了一种含有GO的单体，改善了蛋白质分离效果；Zhou等人制备了一种GO增强的硼酸酯亲和单体，使其表面积增加了近30倍，并提高了糖蛋白的富集选择性和效率[24]、[25]。现有研究表明，经过优化和表面修饰后，GO在生物环境中表现出良好的生物相容性和稳定性，为其在生物传感器、药物载体和组织工程中的应用奠定了基础[26]。

深共晶溶剂（DESs）是一类新型绿色溶剂，由于其低毒性、低挥发性、易于合成和可调性质，在生物分子提取、分离和药物递送方面引起了广泛关注[27]、[28]、[29]。Hayyan等人研究了氯化胆碱（ChCl）与HBD甘油、乙二醇、三乙二醇和尿素混合后的毒性和细胞毒性，发现DESs的细胞毒性远高于其单独组分的毒性[30]。Dai等人通过定制DESs的性质提高了提取效率，然后使用微孔树脂柱层析法从DESs中纯化了生物活性化合物[31]。离子液体（ILs）结合了“绿色”特性和“功能性”，成为优秀的绿色孔隙生成剂[32]。它们的低挥发性减少了环境影响和操作风险[33]，而高溶解度允许溶解多种聚合物和反应物，使其成为理想的反应介质[34]。通过改变阳离子-阴离子组合，ILs可以精确调节孔径、孔隙率和表面化学性质，生成定制的多孔结构。ILs还表现出良好的热稳定性，通常毒性低且可回收[35]、[36]、[37]。

DESs和ILs的协同作用形成的二元体系作为绿色孔隙生成剂，在单体柱的合成中显示出显著优势[38]、[39]。它不仅保留了绿色特性，还允许通过调整DES/IL比例精确调节孔径、比表面积和表面化学性质，从而实现生物大分子的方向性吸附和分离[40]、[41]、[42]。例如，Katerina A. Ioannou等人证明，将基于氨基酸的ILs和DESs与环糊精或环果聚糖手性选择剂结合，显著改善了安非他明衍生物的对映体分离效果，突出了协同效应[43]。通过替代大量挥发性有机溶剂并在温和条件下操作，DES-IL体系为制备高性能单体柱提供了一种创新且环保的方法[32]、[40]。因此，DESs-ILs协同体系为制备高性能、环保的单体柱提供了一种创新的绿色解决方案。

蛋白质的表面电荷与其所在溶液的pH值密切相关[44]。当溶液pH值接近蛋白质的等电点（pI）时，蛋白质的净表面电荷趋近于零，最小化了静电排斥，促进了与具有特定相互作用位点的吸附材料的特异性吸附。基于这一原理，设计pH调节吸附材料可以实现具有特定pI值的蛋白质的有效捕获[45]。

本研究开发了一种含有GO并结合绿色孔隙生成剂的新型毛细管单体柱，利用其pH响应性实现具有特定pI值的蛋白质的高效分离（图1）。通过将GO（PAS-GO）的功能性与绿色制备的毛细管单体的优点相结合，所得的PAS-GO-poly(BMA-co-EDMA)单体不仅继承了GO的优异吸附性能，还赋予了材料可调的孔结构和pH响应性，在绿色提取技术中发挥了重要作用。通过调节样品在单体柱内的pH环境，可以通过改变蛋白质表面电荷实现具有特定pI值的蛋白质的选择性吸附和动态分离。在不同pH条件下定量评估了模型蛋白质牛血清白蛋白（BSA）的吸附能力、选择性和回收率，全面评估了单体柱作为固相萃取（SPE）材料的性能。此外，新开发的PAS-GO-poly(BMA-co-EDMA)单体应用于复杂样本，包括HeLa细胞裂解物和小细胞肺癌（SCLC）患者血浆。通过调节样品的pH值，实现了特定pI值的生物标志物蛋白质的特异性提取和高灵敏度检测，从而证明了PAS-GO-poly(BMA-co-EDMA)单体柱在复杂生物样本中快速高效分离特定蛋白质方面的潜力。

部分摘录

DESs的制备

将ChCl和EtOH的混合物在油浴中加热至90°C并不断搅拌，直至获得均匀透明的溶液。使用比重计测量并计算DESs的密度以研究其性质。实验程序基于GB/T 13377–2010标准，在操作过程中进行了必要的修改。DESs的过量摩尔体积（$$）使用以下公式计算：$$这里，ρ表示密度

DESs的设计与合成

由于DESs的独特性质，本研究制备并使用了这种新型绿色溶剂。通过调整氢键供体乙醇和氢键受体ChCl的摩尔比例，优化了DESs的物理化学性质。乙醇的低毒性和生物降解性符合绿色化学的原则。其适中的沸点和低粘度赋予DESs良好的溶解性和流动性，有效降低了熔点

结论

在本研究中，我们通过使用绿色二元孔隙生成剂并掺入GO，成功制备了一种具有高吸附能力和选择性的毛细管单体柱。在控制加载pH为5的条件下，与不含GO的单体相比，PAS-GO-poly(BMA-co-EDMA)单体对模型蛋白质表现出显著的富集能力（回收率>95%，吸附能力26.13 mg/g）和良好的稳定性（RSD = 2.04%）。此外，通过替换传统

CRediT作者贡献声明

xue zhang：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化。Yufei Shi：可视化。Huiying Zhang：可视化。Rui Wu：资源。Fenghua Xu：撰写 – 原稿。Zhaosheng Liu：可视化。Xin Dong：可视化

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：22304002）的资助。