Leritrelvir重新定位用于治疗柯萨奇病毒B4和常见肠道病毒感染的潜力

《Antiviral Research》：The potential of leritrelvir repositioning for the treatment of coxsackievirus B4 and common enterovirus infections

本研究评估了Leritrelvir对CVB4及常见肠道病毒的抗病毒活性。通过分子对接和体外/体内实验，证实Leritrelvir能有效抑制CVB4复制，阻止死亡，减轻症状及病理损伤，且对EVA71、CVA16和HRV2亦有效，优于氟西汀，提示其作为广谱抗EV药物潜力。

　　

刘倩|唐碧珍|宣向林|王环|刘浩毅|张莉|邱淑燕|尤爱萍|莫春聪|李小|周蓉|王长兵|田星贵|刘文宽

中国广东省药科大学第一附属医院科研中心

摘要

肠病毒（EVs）对人类健康构成重大威胁，其中柯萨奇病毒B4型（CVB4）因其高致死性、日益增长的流行率以及缺乏批准的针对性治疗方法而尤为引人注目。Leritrelvir是一种获批用于治疗2019冠状病毒病（COVID-19）的药物，其作用靶点是严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的3C样蛋白酶（3CL^pro）。由于EV 3C蛋白酶（3C^pro）与SARS-CoV-2 3CL^pro在结构和功能上的相似性，研究人员探讨了Leritrelvir的重新用途。分子对接分析表明，Leritrelvir与CVB4 3C^pro活性位点的结合方式与它与SARS-CoV-2 3CL^pro的结合方式相似。体外实验显示，Leritrelvir能够在HeLa细胞中抑制CVB4的复制，其半数有效浓度（EC₅₀）为12.64 nM。Leritrelvir在HeLa细胞中的半数细胞毒性浓度（CC₅₀）为572.7 μM，选择性指数（SI=CC₅₀/EC₅₀）为4.53×10⁴。在感染CVB4的3日龄ICR小鼠中，Leritrelvir以剂量依赖的方式抑制了病毒复制。给予Leritrelvir（12 mg/kg/天）可防止死亡、缓解临床症状和体重下降，并减轻病毒靶器官（如大脑、肺、心肌和小肠）的组织病理损伤。此外，Leritrelvir还能有效抑制CVB4诱导的白细胞介素-6升高。与参考药物氟西汀相比，Leritrelvir在体外和体内均表现出更强的抗CVB4效果。实验结果还证实，Leritrelvir对CVB4临床分离株及其3C^pro突变体也具有高效活性，说明其对CVB4变体具有广谱抗病毒作用。体外和计算机模拟分析显示，Leritrelvir对EVA71、CVA16和人类鼻病毒2型也具有强大的抗病毒效果。这些发现支持了将Leritrelvir重新用于治疗CVB4和其他常见肠病毒的潜力。

引言

肠病毒（EVs）属于Picornaviridae科，是公认的病原体，可引起婴儿和幼儿的多种传染病，从轻微疾病到危及生命的状况都有。最近的分子监测和基因分型研究已经确定了15种人类肠病毒（Enterovirus A–L和Rhinovirus A–C）以及超过116种不同的基因型。其中，Enterovirus A–D和Rhinovirus A–C是导致人类感染的主要病原体（Xie et al., 2024; Zell et al., 2017）。

在常见的肠病毒中，柯萨奇病毒B4型（CVB4）是CVB组的重要成员（Baggen et al., 2018）。该病毒通过粪-口途径和呼吸道飞沫传播，有可能引发大规模暴发（Khetsuriani et al., 2006a; Nekoua et al., 2022; Porres et al., 1985）。CVB4感染可引发多种疾病，包括无菌性脑膜炎、手足口病（HFMD）、急性呼吸道疾病、病毒性心肌炎、急性胰腺炎和1型糖尿病（Bissel et al., 2014; Dai et al., 2023; Dong et al., 2018; Hindersson et al., 2004; Nekoua et al., 2020; Nekoua et al., 2021; Xiao et al., 2021）。流行病学研究表明，CVB4是一种特别致命的肠病毒；严重的神经系统损伤是导致重症和死亡的主要原因（Hu et al., 2012; Khetsuriani et al., 2006a; Khetsuriani et al., 2006b; Porres et al., 1985）。最近对中国云南地区重症HFMD患者的研究显示，CVB4已成为第二常见的肠病毒血清型——仅低于EVA71——这凸显了加强预防和控制措施的迫切需求（Liu et al., 2023）。

其他具有临床意义的肠病毒类型包括柯萨奇病毒A16型（CVA16）和人类鼻病毒（HRVs）。除了EVA71，CVA16也是导致HFMD的主要病原体（Mao et al., 2014）。HRVs包含多种基因型，是普通感冒最常见的致病因子；它们还可能引起严重的下呼吸道感染（Andrup et al., 2023）。

虽然通过长期的系统疫苗接种计划，脊髓灰质炎已被有效控制（Bandyopadhyay et al., 2024），但针对其他肠病毒的治疗干预措施仍然非常有限。临床管理主要依赖于对症和支持性治疗。对于CVB4，氟西汀是一种选择性的5-羟色胺摄取抑制剂，在体外和体内都能阻断CVB4蛋白2C，从而抑制病毒复制（Ulferts et al., 2013; Zuo et al., 2012），并且已被证明能在体外和体内有效抑制CVB4的复制（Benkahla et al., 2018）。其他实验性抗病毒药物包括埃莫丁（Liu et al., 2013）、Yakammaoto（Yen et al., 2014）和乌米芬诺韦（Zhang et al., 2023; Zhang et al., 2017）。某些细菌及其衍生物也表现出对CVB4的抗病毒活性，例如Bifidobacterium分泌的脂壁酸聚集体（El Kfoury et al., 2017）和Lactobacillus plantarum（Arena et al., 2018）。针对其他常见肠病毒血清型，多种化合物正在积极研究中（Lu et al., 2011; Ren et al., 2023; Valbuena et al., 2018; Wang et al., 2024a; Wei et al., 2024; Yuan et al., 2023）。目前尚无获批的针对CVB4的靶向药物或广谱抗肠病毒药物，因此这一领域的研究和开发至关重要。

Leritrelvir（通用名；开发代号RAY1216）是一种肽模拟抑制剂，针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的3C样蛋白酶（3CL^pro，也称为M^pro），已在中国被批准作为2019冠状病毒病（COVID-19）的单一疗法。对SARS-CoV-2 3CL^pro-Leritrelvir复合物的晶体学分析表明，Leritrelvir通过其α-酮酰胺基团与催化残基共价结合（Chen et al., 2024）。临床试验表明，Leritrelvir单药治疗可显著降低病毒载量，缩短COVID-19症状持续时间，并保持良好的安全性（Wang et al., 2023）。

EV 3C蛋白酶（3C^pro）是一种关键酶，负责将病毒多聚蛋白切割成成熟的功能成分，并与宿主蛋白相互作用以促进病毒复制；它是抗病毒药物开发的主要靶点（Garmaroudi et al., 2015; Lin et al., 2009）。EV 3C^pro和SARS-CoV-2 3CL^pro都属于类胰蛋白酶蛋白酶，具有高度相似的晶体结构。两者都包含两个β-桶状结构域（每个结构域有六个β-折叠片），催化活性中心位于这两个结构域之间的裂隙中（Chen et al., 2024; Jiang et al., 2024; Kawatkar et al., 2016; Lu et al., 2011）。值得注意的是，CVB4 3C^pro在这个裂隙中包含一个特定的催化三联体（H40–E71–C147），其功能类似于SARS-CoV-2 3CL^pro的催化中心（H41–C145–D187），对病毒多聚蛋白的加工至关重要（Chen et al., 2024; Jiang et al., 2024; Kawatkar et al., 2016; Lu et al., 2011）。这种结构上的相似性为将Leritrelvir重新定位为潜在的抗肠病毒药物提供了有力依据。

本研究使用体外和体内模型评估了Leritrelvir对CVB4和其他常见肠病毒血清型的疗效，旨在探讨其在治疗CVB4和其他肠病毒感染中的潜在用途。

部分内容摘录

伦理声明

动物实验是在广州医科大学第一附属医院伦理委员会批准的方案下进行的。使用特定的无特定病原体的ICR哺乳期小鼠（中国西贝福）建立了动物模型。所有关于实验室动物护理和使用的机构指南都得到了严格遵守。

细胞和病毒

HeLa细胞易受CVB4感染（Dai et al., 2023）。HeLa细胞（#CCL-2; ATCC, USA）和Vero E6细胞（#CRL-1586; ATCC）在Dulbecco培养基中培养

Leritrelvir与CVB4 3C^pro的计算机对接

包括CVB4、EVA71、CVA16、HRV2在内的肠病毒的3C^pro蛋白以及SARS-CoV-2的3CL^pro均被归类为类胰蛋白酶蛋白酶，具有很强的结构相似性（图S1）。Leritrelvir是一种用于治疗COVID-19的商用单药，其治疗效果是通过特异性抑制SARS-CoV-2 3CL^pro实现的（Wang et al., 2023）。计算机对接分析表明，Leritrelvir与CVB4 3C^pro的结合方式与其与SARS-CoV-2 3CL^pro的结合方式非常相似。

讨论

肠病毒是一组遗传多样性高的病原体，具有全球性流行特征；它们导致了婴儿和幼儿持续的发病率和死亡率（Mulders et al., 2000）。近年来，CVB4的流行率有所增加，这凸显了开发有效预防和治疗方法的迫切需求

CRediT作者贡献声明

田星贵：撰写——审稿与编辑、资源整理、方法学设计、数据分析。唐碧珍：撰写——初稿撰写、方法学设计、实验实施、数据分析、数据管理。宣向林：撰写——初稿撰写、方法学设计、实验实施、数据分析、数据管理。周蓉：撰写——审稿与编辑、资源整理。王长兵：撰写——审稿与编辑、资源整理、方法学设计、数据分析。刘倩：撰写——审稿与编辑、资源整理、方法学设计、资金筹集

数据声明

本研究生成或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号：31900877）和国家重点科技项目（编号：2018ZX10102001）的支持。资助方未参与研究设计、数据收集或解释，也未参与决定将研究成果发表。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢广州医科大学的邓铮博士在手稿准备过程中的宝贵讨论和意见。同时感谢周英华、马静、李静茹和王彤在技术上的协助。