《Archives of Oral Biology》：Differentiation of neural stem cells derived from human stem cells from apical papilla into neuronal-like cells undergoing maturation via 3D-neurospheres formation and neurogenic induction
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为解决神经系统疾病治疗中功能性神经元来源稀缺和伦理限制问题，本研究探索了一种新型细胞源——人根尖乳头干细胞(hSCAPs)。研究通过三维神经球形成将其诱导为神经干细胞(NSCs-hSCAPs)，并进一步进行神经源性诱导。结果显示，分化后的细胞表现出神经元样形态、神经元标志物表达变化以及膜兴奋性，证明了其分化为功能神经元样细胞并走向成熟的能力。这项研究为神经退行性疾病的干细胞替代疗法提供了有潜力的细胞来源。
阿尔茨海默病、帕金森病、中风等中枢神经系统疾病影响着全球范围内约10%的老年人，其发病率和死亡率居高不下。随着人口老龄化和预期寿命延长，神经系统疾病的患病率持续攀升。然而，目前针对这些疾病的治疗方法非常有限，传统的药物和治疗手段难以实现根治。更严峻的是，大脑疾病涉及复杂多样的分子和通路，加之神经元本身的再生能力极为有限，使得治疗策略的探索充满挑战。面对这种困境，干细胞移植疗法逐渐成为一种颇具前景的治疗选择。但理想中的干细胞来源需要满足几个苛刻条件：易于获取、伦理争议小，并且拥有强大的向神经细胞分化的潜能。
正是在这样的背景下，一种来源于“牙齿废料”的细胞——人根尖乳头干细胞(human stem cells from apical papilla, hSCAPs)走入了研究者的视野。它们位于未成熟发育牙齿的根尖，在拔除智齿时即可获得，来源广泛且伦理顾虑低。更重要的是，hSCAPs来源于外胚间充质，其祖细胞是迁移的神经嵴干细胞，这使得它们天生就具备优异的神经分化潜力。那么，能否将这种“废弃”的牙源性干细胞，诱导成可用于神经系统疾病治疗的神经细胞呢？这正是发表在《Archives of Oral Biology》上的一项研究试图解答的核心问题。
为了探究这一问题，研究人员采用了一套组合拳式的技术路线。首先，他们从泰国患者的阻生第三磨牙中分离并培养了hSCAPs，并对其进行了干细胞特性表征。接着，研究的关键第一步是三维神经球形成：将hSCAPs在超低吸附培养板中，使用含有表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的神经诱导培养基培养5天，使其形成自由漂浮的细胞团块——神经球。第二步是神经源性诱导：将第5天的神经球解离成单个细胞，接种在包被了多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白的培养板上，使用含有B-27 Plus和L-谷氨酰胺的神经源性诱导培养基继续培养7天，以促进其向神经元方向分化。为了全面评估分化效果，研究者运用了多种检测手段：通过甲酚紫染色鉴定神经元特有的尼氏物质(Nissl substance)；通过免疫细胞化学分析神经相关蛋白（巢蛋白(Nestin)、SOX2、β-III微管蛋白(Beta-III tubulin)和微管相关蛋白2(MAP2)）的表达；通过实时逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR) 定量检测相关基因（NES、SOX2、TUBB3、MAP2、SV2A）的mRNA表达水平；最后，通过钙成像(calcium imaging) 技术，观察细胞在氯化钾(KCl)刺激下引发的去极化诱发的细胞内钙离子(Ca2+)响应，以此评估细胞的膜兴奋性。
研究结果部分通过一系列实验，清晰地展示了hSCAPs向神经元样细胞分化的全过程和关键特征。
3.1. 三维神经球形成和神经诱导下的细胞形态
结果显示，未分化的hSCAPs呈现典型的成纤维细胞样形态，具有良好的贴壁能力。经过5天的三维神经球诱导后，细胞形成了自由漂浮的三维细胞聚集体。将这些神经球解离后得到的细胞呈圆形。最关键的变化发生在7天神经诱导之后：大部分分化细胞表现出典型的神经元样形态，包括胞体增大和神经突样过程的伸长。这表明诱导程序成功地改变了细胞的形态，使其向神经元表型转变。
3.2. 尼氏物质分析
甲酚紫染色用于鉴定尼氏物质，这是神经元细胞质中粗糙内质网的特征。hSCAPs仅显示细胞核的淡紫色染色，为阴性染色模式。相比之下，来自三维神经球的NSCs-hSCAPs和诱导7天后的神经元样细胞均显示出强烈的紫色胞质染色，呈阳性模式。这从细胞组分层面证实了分化细胞具备了神经元的特征。
3.3. NSCs-hSCAPs和神经元样细胞的免疫荧光分析
通过检测一系列标志物蛋白的表达，研究人员分析了细胞在分化过程中的身份转变。神经球中的细胞高表达神经干性标志物巢蛋白和SOX2，表明它们具有神经干细胞特性。经过7天神经诱导后，分化细胞中的巢蛋白表达依然可检测，但SOX2的表达显著减弱，这意味着细胞的干性特征在减少。与此同时，神经元细胞骨架标志物β-III微管蛋白和神经元成熟相关标志物MAP2的表达，在神经元样细胞中比在神经球中更为强烈。这表明细胞正在从干/祖细胞状态向早期神经元表型转变并走向成熟。
3.4. NSCs-hSCAPs和神经元样细胞的阶段相关性神经标志物谱
对蛋白和mRNA水平的定量分析进一步印证了上述变化。与神经球相比，神经元样细胞中巢蛋白和SOX2的荧光强度及基因（NES和SOX2）表达均显著下降，而早期神经元分化相关标志物β-III微管蛋白及其基因TUBB3的表达则显著增加。MAP2及其基因MAP2的表达水平呈上升趋势，但未达到统计学显著性。重要的是，在神经元样细胞内部比较发现，神经元相关标志物（β-III微管蛋白和MAP2）的荧光强度显著高于干性相关标志物（巢蛋白和SOX2）。这些数据共同表明，细胞的身份特征从干性相关标志物表达转向了神经元相关标志物谱。
3.5. 突触小泡相关特征和去极化诱发的钙响应
在mRNA水平上，突触小泡糖蛋白2A(SV2A)基因在NSCs-hSCAPs和神经元样细胞中均有检测，提示了突触小泡相关分子特征的存在。功能层面的验证通过钙成像实现。使用钙敏感染料Fluo-3 AM检测细胞内钙离子动态变化。当用50 mM KCl在60秒时间点刺激细胞诱发膜去极化时，作为非神经元参照的hSCAPs仅显示微弱的ΔF/F0波动，而神经元样细胞则表现出清晰的、瞬时的ΔF/F0峰值增加。定量分析显示，神经元样细胞在KCl刺激后的峰值ΔF/F0值显著高于hSCAPs。这表明分化后的细胞获得了对去极化刺激的敏感性以及电压门控钙通道的功能，这是早期神经元分化的重要功能特征。
本研究得出结论，通过三维神经球形成和随后的神经源性诱导，可以成功地将来源于人根尖乳头干细胞的神经干细胞(NSCs-hSCAPs)分化为正在走向成熟的神经元样细胞。研究证实，hSCAPs来源的细胞在诱导后，其形态、分子标志物表达谱和功能特性均发生了符合神经元分化趋势的系列变化：干性标志物下调，神经元结构蛋白标志物上调，并表现出膜兴奋性。讨论部分深入分析了这些发现的意义。hSCAPs作为一种易于获取、伦理争议小的牙源性间充质干细胞，其神经嵴起源赋予了它天然的神经分化优势。三维培养体系模拟了体内微环境，有利于维持细胞干性和诱导神经分化。研究成功建立的分化方案，结合形态学、分子生物学和功能学（钙成像）的多维度验证，为利用hSCAPs生成功能性神经元样细胞提供了一个可行的框架。
这项研究的重要意义在于，它为解决神经系统疾病细胞治疗中功能性神经元来源匮乏的瓶颈问题，提供了一个极具潜力的新方案。hSCAPs可以从常规拔除的智齿中轻松获得，避免了从大脑直接分离神经干细胞的侵入性和伦理问题。研究证实了其分化的细胞不仅具有神经元样形态和分子特征，还具备初步的电生理功能（膜兴奋性），这为后续的体内移植研究和临床转化奠定了基础。尽管分化出的细胞尚未达到完全成熟神经元的状态，且细胞群的谱系构成（是否混有胶质细胞）有待进一步解析，但这项工作无疑为开发基于hSCAPs的神经再生疗法迈出了关键一步。未来，通过优化诱导条件、延长培养时间并结合更全面的功能验证（如膜片钳记录动作电位），有望获得功能更成熟的神经元，最终推动其在阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病及脑损伤修复中的临床应用。
