《Biochemical Pharmacology》：Bivalent ligands targeting oxytocin receptor homodimers selectively activate distinct G protein and β-arrestin pathways
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为了解决催产素受体（OTR）同源二聚体功能未知，以及开发更精准、高效、副作用少的神经精神疾病治疗药物的问题，研究人员开展了一项关于特异性靶向OTR同源二聚体的双价配体化合物的功能研究。他们发现，具有特定长度连接链的双价配体dOTK2-C8和dOTK2-C10能选择性激活OTR/Gq、OTR/Gi2、OTR/Gi3通路，并独特地招募β-逮捕蛋白1（β-arrestin 1），从而为开发治疗自闭症谱系障碍、精神分裂症等社交缺陷疾病的新型靶向疗法提供了框架。
催产素（Oxytocin, OT）常被称为“爱的荷尔蒙”，在哺乳动物的社交行为、认知共情和人际信任中扮演着关键角色。基于其在促进社会互动方面的潜力，科学家们一直希望将催产素或其类似物开发成治疗自闭症谱系障碍、精神分裂症等以社交缺陷为核心的神经精神疾病的药物。然而，临床实验结果却令人沮丧，患者对催产素的反应差异巨大且不稳定。这背后一个核心难题在于：催产素通过其受体——催产素受体（Oxytocin Receptor, OTR）发挥作用，而OTR属于G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptor, GPCR）大家族，就像一个细胞表面的精密“信号交换机”。当被催产素激活后，这个“交换机”可以同时接通多条“电话线”，包括不同的G蛋白（如Gq、Gi/o）和β-逮捕蛋白（β-arrestin）通路，这些通路在不同细胞中可能产生协同甚至相反的效应。传统的催产素疗法如同同时拨通了所有线路，难以控制最终产生的“信号杂音”，导致疗效不可预测且可能伴随副作用。因此，开发能够精准激活特定信号通路（即具有“信号偏倚性”的配体，已成为下一代GPCR药物研发的热点。
此外，越来越多的证据表明，GPCR并非总是以“单身”（单体）形式工作，它们经常“手拉手”形成二聚体甚至多聚体。OTR也是如此，它能形成由两个相同亚基组成的同源二聚体。这些二聚体在天然脑组织中已被证实存在，并且可能是一个全新的药物靶点。那么，一个激动人心的设想产生了：如果能设计出一种药物，像一把“分子双头锁”一样，同时、精确地结合到OTR同源二聚体的两个亚基上，是否不仅能增强药效，还能诱导出单体无法形成的独特信号构象，从而实现前所未有的通路选择性呢？这正是Marta Busnelli、Alessandro Gori和Bice Chini团队在本研究中试图回答的问题。他们的研究成果最终发表在《Biochemical Pharmacology》上。
为了深入探究OTR同源二聚体的信号特性，研究人员主要依赖于几种关键技术方法。首先，他们采用了生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET）生物传感器技术。这好比在细胞内的信号分子上安装“能量探针”：通过将荧光蛋白或荧光素酶与特定的G蛋白α亚基（如Gαi2、Gαi3）或β-逮捕蛋白（β-arrestin 1/2）融合，当配体激活受体导致这些信号分子发生构象变化或相互靠近时，BRET信号便会发生改变，从而实时、定量地监测特定信号通路的激活或募集情况。其次，他们利用共聚焦显微镜成像技术，直接可视化观察β-逮捕蛋白向细胞膜的募集以及与OTR的共定位，以及OTR受体的内吞过程，为BRET数据提供了直观的形态学证据。研究所用的细胞模型主要为转染了人OTR及相关信号分子的人胚胎肾细胞（HEK293），并使用了稳定表达OTR-绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白的细胞系来研究受体内存。所有双价配体及对照单体配体dOTK均通过固相合成法制备。
研究结果
3.1. dOTK和双价配体选择性激活特定OTR/G蛋白复合物
研究人员测试了一系列由两个修饰过的OT类似物（dOTK）通过不同长度碳链（C6至C14）连接而成的双价配体。利用BRET2生物传感器监测发现，与催产素（OT）能广泛激活Gq、Gi1、Gi2、Gi3、GoA和GoB不同，单体dOTK和所有双价配体都表现出选择性：它们只激活Gq、Gi2和Gi3，而对Gi1、GoA和GoB没有激活作用。这表明这些配体是偏向性激动剂，能选择性地将OTR的信号引导至特定的G蛋白通路。
3.2. 双价配体以单调曲线激活OTR/Gi2和OTR/Gi3
研究人员进一步绘制了浓度-反应曲线。在之前的工作中，dOTK2-C8和dOTK2-C10在激活OTR/Gq时显示出双相曲线，提示其能以极高亲和力（皮摩尔级）激活二聚体状态下的OTR。然而，在激活OTR/Gi2和OTR/Gi3时，包括dOTK2-C8和dOTK2-C10在内的所有配体都只产生单调曲线，其半数最大效应浓度（EC50）普遍高于OT。这暗示对于Gi2和Gi3的激活，可能不依赖于配体同时结合二聚体两个亚基的高亲和力模式。
3.3. 双价配体dOTK2-C8和dOTK2-C10是唯一能同时触发β-逮捕蛋白1和2募集的配体
β-逮捕蛋白的募集是GPCR信号转导和脱敏的关键步骤。通过BRET1生物传感器和共聚焦显微镜成像，研究人员有了惊人的发现：所有测试的配体（dOTK及双价配体）都能募集β-逮捕蛋白2，但只有连接链长度为8和10个碳原子（C8和C10）的双价配体dOTK2-C8和dOTK2-C10能够有效募集β-逮捕蛋白1。显微镜图像清晰显示，这两种配体刺激后，原本弥散在细胞质中的β-逮捕蛋白1和2迅速向细胞膜转移，并与OTR形成共定位的荧光斑点。这揭示了dOTK2-C8和dOTK2-C10具有独特的、能同时招募两种β-逮捕蛋白亚型的能力。
3.4. dOTK和所有双价类似物均诱导OTR内吞
受体激活后内吞是脱敏的常见机制。有趣的是，尽管这些配体表现出G蛋白激活的偏向性，但它们都像OT一样，能够有效促使OTR从细胞膜内陷进入细胞内，形成内体囊泡，这表明它们诱导的β-逮捕蛋白募集足以驱动受体内化过程。
研究结论与讨论
本研究系统阐明了靶向OTR同源二聚体的双价配体独特的信号偏倚特性。核心结论是：dOTK2-C8和dOTK2-C10通过稳定OTR的跨膜螺旋1-跨膜螺旋2-螺旋8（TMH1–TMH2–Helix8）同源二聚体构象，能够选择性激活Gq、Gi2和Gi3蛋白通路，并独特地具备同时高效募集β-逮捕蛋白1和β-逮捕蛋白2的能力。这种“一石多鸟”却“精准制导”的特性，使其成为前所未有的药理学工具。
在讨论中，作者对现象背后可能的机制进行了深入探讨。关于为何Gi2/Gi3激活呈单调曲线，而Gq激活有双相曲线，作者提出了两种假说：其一，Gi2/Gi3可能主要与OTR单体偶联，因此双价配体未显示出高亲和力结合的优势；其二，OTR可能存在不同的二聚化界面（如TMH5/TMH5界面），该界面可能偏好与Gi2/Gi3偶联，而本研究中的双价配体因其连接链长度所限，无法有效靶向该界面。关于β-逮捕蛋白1的特异性募集，作者认为这可能与dOTK2-C8/C10诱导的特殊二聚体构象有关。β-逮捕蛋白1在成年大脑中丰度远高于β-逮捕蛋白2，并能进入细胞核调控基因转录，影响焦虑、奖赏等行为。因此，能够特异性招募β-逮捕蛋白1，可能赋予了dOTK2-C8/C10更优的药理特性和治疗潜力，这与其之前在动物模型中展现出的强大促社交行为增效作用相得益彰。
综上所述，这项研究不仅证实了OTR同源二聚体是一个功能独特的、可靶向的药理学实体，而且成功开发出了能精准操控其信号输出的“分子钥匙”——dOTK2-C8和dOTK2-C10。这些双价配体为在分子层面解析GPCR二聚化如何精确调控细胞信号提供了强大工具。更重要的是，它们为治疗因催产素信号异常导致的、以社交缺陷为核心特征的神经发育和精神疾病（如自闭症谱系障碍和精神分裂症），开辟了一条基于受体二聚体靶向和信号通路精准调控的全新药物研发路径。本研究标志着在理解复杂GPCR信号网络和开发下一代神经精神疾病疗法方面迈出了关键一步。
