《Journal of Apicultural Research》：Amitraz toxicity in resistant Varroa mites can be increased by inhibiting ABC efflux transporters
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本研究揭示，在农业传粉关键物种西方蜜蜂中，其毁灭性寄生虫——狄斯瓦螨（Varroa destructor）对常用杀螨剂双甲脒（amitraz）的抗性，可通过药理学手段加以克服。研究证实，使用维拉帕米（verapamil）抑制螨虫体内的ABC（ATP-binding cassette）外排转运蛋白，能协同增强双甲脒的毒性，即使在抗性基因型比例高达88.5%的螨群中亦然。这一发现为开发新型增效剂、延长现有杀螨剂使用寿命及管理抗性提供了新思路，但需审慎考虑ABC转运蛋白对蜜蜂自身解毒功能同样关键的影响。
摘要
作为农业作物的重要传粉者，西方蜜蜂（Apis mellifera）在粮食生产中扮演着至关重要的角色。因此，研究与开发控制狄斯瓦螨（Varroa destructor）的新方法势在必行。这是一种破坏性极强的寄生螨，会削弱蜂群并传播致命疾病，最终导致蜂群崩溃。本研究通过改良现有方法，探究了ABC外排转运蛋白在缓解双甲脒毒性中的作用。双甲脒是一种被批准用于蜂群的广谱杀螨剂。结果表明，与同等剂量的双甲脒单独处理相比，药理抑制剂维拉帕米能够协同增强双甲脒的毒性。对其中一项实验所用螨虫的评估显示，测试螨虫中有很高比例（88.5%）拥有双甲脒抗性基因型，这表明即使是在抗性螨虫中，抑制ABC外排转运蛋白也能提高双甲脒的效力。这一有前景的发现可能有助于开发强效的协同增效剂，用以提升新型和现有杀螨剂的功效，但必须谨慎行事，因为ABC外排转运蛋白对蜜蜂自身的解毒过程也至关重要。
引言
由管理蜂群提供的授粉服务对全球众多作物的生产至关重要，但由于多种生物和非生物因素造成的持续压力，许多养蜂人报告称每年都经历着不可持续的蜂群损失。尽管造成这些损失的原因多样，但普遍认为狄斯瓦螨的寄生是对蜂群最有害且最普遍的压力源。狄斯瓦螨原产于亚洲，是东方蜜蜂（Apis cerana）的寄生虫。虽然其转宿主到西方蜜蜂的确切年份未知，但推测发生在十九世纪上半叶，并于1987年在美国首次报告。自此，它已成为该国最具破坏性和经济意义的蜂群害虫。
狄斯瓦螨在蜜蜂封盖的幼虫房中繁殖。在此之前，雌性成螨以成年工蜂和雄蜂为食。通过蜜蜂的漂移或盗蜂行为，螨虫可以在蜂群间传播，从而快速扩散侵染。狄斯瓦螨通过取食蜜蜂组织以及传播如残翅病毒、以色列急性麻痹病毒等致命病毒来危害蜜蜂，导致个体蜜蜂衰弱和感染病毒，进而造成蜂群层面种群数量下降和损失。
尽管狄斯瓦螨危害巨大，但养蜂人可用的控制工具有限。诱导断子期以阻止螨虫繁殖等文化措施以及移除雄蜂脾可能有一定效果，但在商业化规模上并非总是可行，且通常需要与其他控制方法结合使用。同样，具有抗螨特性的蜜蜂品系虽已存在，但养蜂人往往因蜂群发展速度和性情等其他理想性状而选择品系。目前，最广泛使用的狄斯瓦螨控制方法是化学方法。
与其他农业市场相比，注册用于蜂群控制狄斯瓦螨的农药产品很少。目前最广泛使用的杀螨剂之一是双甲脒，这是一种合成的甲脒类杀螨剂，模拟章鱼胺和酪胺的活性。双甲脒通常以Apivar?（缓释条）或Amiflex?（速释凝胶）等经美国环保署（EPA）批准的产品形式在蜂群内使用。双甲脒因其对狄斯瓦螨的高效性和对蜜蜂的低毒性而备受青睐，但近年来由于螨群中抗性的演变，对其使用的担忧日益增加。这种抗性是由β2-章鱼胺受体突变引起的。虽然影响受体选择性的靶点抗性突变会深刻影响双甲脒的单独毒性，但针对代谢抗性背后生物学因素的农业增效剂可能提供有前景的解决方案。能够通过抑制外排转运蛋白来影响双甲脒的细胞摄取和积累的增效剂，可能有助于克服这种抗性。
参与多药/异生物质抗性（MDR/MXR）的ATP结合盒（ABC）转运蛋白通常是抵御多种农药、药物及其他有毒化学物质或代谢物细胞摄取的第一道防线。通过立即识别并外排底物化学物质，MDR/MXR型ABC转运蛋白提供了针对化学损害的快速、节能且通用的细胞防御反应。尽管这些外排转运蛋白的同源物已在众多节肢动物类群中被识别，并在广谱杀虫剂的解毒过程中反复发挥主要作用，但狄斯瓦螨及其他害虫生物中由ABC守门蛋白调控的农药识别和细胞进入机制尚未完全阐明。如果杀螨剂被识别为这些转运蛋白的底物，抑制转运蛋白则可能增加细胞内的杀螨剂积累，从而使螨虫对其毒性效应更敏感。这种化学增敏过程在几十年前就在水生物种中被描述，此后在其他脊椎动物和无脊椎动物中也观察到。
在节肢动物中，最普遍且特征最明确的ABC转运蛋白之一是MDR49，也称为P-糖蛋白或ABCB1。该蛋白的自然突变和过表达已知对蚊子、烟芽夜蛾和果蝇的杀虫剂解毒至关重要。相应地，这些转运蛋白的基因敲低、多种农药共同暴露以及药理学抑制，可以使害虫和蜜蜂对有毒化学物质的积累更敏感。例如，在果蝇（Drosophila melanogaster）中，两种P-糖蛋白MDR50和MDR65的RNA干扰敲低增加了对滴滴涕和伊维菌素的敏感性。同样，在微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）中，使用环孢素A药理学抑制ABCB型转运蛋白，增强了对伊维菌素、阿维菌素、莫西菌素和毒死蜱的敏感性。在赤拟谷盗（Tribolium castaneum）中，使用ABC外排转运蛋白抑制剂维拉帕米处理同样提高了对除虫脲的敏感性。
本研究改良了现有的杀螨剂毒性评估方法，用以研究双甲脒和ABC外排转运蛋白抑制剂维拉帕米单独及联合使用对狄斯瓦螨的影响，以阐明ABC外排转运蛋白在缓解双甲脒对狄斯瓦螨毒性中的作用。此外，在季节后期观察到螨虫对双甲脒表现出惊人的高耐受性后，我们对用于后期生物测定的螨虫进行了双甲脒抗性基因型定量分析，以确认抗性并展示ABC转运蛋白如何影响抗性群体中双甲脒的毒性。
材料与方法
螨虫采集
通过向蜂群撒糖粉收集螨虫。简而言之，在位于加州戴维斯市传粉昆虫健康实验室五英里范围内的两个养蜂场（记为养蜂场A和B）中，对选定蜂群的巢脾上方筛撒糖粉。选定的蜂群源自同一遗传谱系（Apis mellifera ligustica），并由来自同一北加州蜂王育种者的蜂王领导。采集活动前，观察到蜂群状况良好，蜂王产卵积极，且有封盖和未封盖的幼虫。蜂群关闭二十分钟后，收集从成年蜜蜂身上脱落的非繁殖期成螨。螨虫在实验室中采用改良自已发表方案的方法饲养。将螨虫直接带到传粉昆虫健康实验室，用湿棉签轻轻清洁，并将五只一组置于从同一养蜂场的蜂群中获得的白色或粉红眼蛹上。每次测定，从两个蜂群采集螨虫并在清洁前混合。将蛹放入00号明胶胶囊中，并置于设定为34.5°C的恒温箱内的干燥器中。使用放置在底部的饱和氯化钠水溶液托盘，将干燥器内的相对湿度维持在75%。在施用处理前，螨虫在干燥器中最多放置3小时。
双甲脒和维拉帕米暴露
采用微注射器对螨虫背侧角质层施用精确量的处理溶液，该方法改编自Bahreini等人的研究。在施用处理前，将螨虫放入衬有蜡础的半边100毫米培养皿中，因为观察到使用蜡衬里时螨虫活动性降低。使用配备33G斜面NanoFil针头的UMP3 Micro2T微注射器，在不让液体接触口器、须肢或螯肢的情况下，将指定体积的处理溶液施用于螨虫背侧角质层。施用处理后，将螨虫以5只一组放回置于明胶胶囊中的蛹上。蛹再次放入设定为前述条件的恒温箱内的干燥器中，并在最多48小时内以24小时间隔检查螨虫存活情况。通过用牙签轻轻触碰螨虫后观察无运动来判断其死亡。
实验处理
实验一
于2024年8月7日进行了初步剂量探索实验，检验两种剂量的双甲脒（0.0117和0.0234 ng/螨）和两种剂量的维拉帕米（0.197和0.394 ng/螨）的效果。双甲脒剂量基于先前研究的结果，该研究发现使用类似方法，对每只螨虫暴露于0.0117 ng双甲脒会导致测试群体37.5%的死亡率。两种维拉帕米剂量是通过将双甲脒剂量的摩尔当量乘以十倍得到的。额外处理包括双甲脒和维拉帕米的组合（0.0117 ng双甲脒 + 0.197 ng维拉帕米/螨 和 0.0234 ng双甲脒 + 0.394 ng维拉帕米/螨）以及溶剂对照。每种双甲脒和维拉帕米的组合均通过单次溶剂施用给予。所有处理均溶于150 nL丙酮中施用，每个处理组使用15只螨虫。如果一只螨虫在施用处理后、被放置到蛹上之前死亡，则将其从实验中排除，因为无法区分其死亡是由于处理不当还是其他原因。这导致某些处理组螨虫数量最少为13只。螨虫采集自养蜂场A的两个蜂群。在处理施用24小时后评估螨虫存活率。
实验二
基于实验一的结果，于2024年8月14日进行了另一项杀螨剂暴露实验。此次，相对于实验一中使用的低剂量双甲脒，将双甲脒剂量增加了4倍，达到0.0468 ng/螨。基于实验一的结果（该结果表明0.197 ng维拉帕米单独使用不会导致螨虫死亡），实验二中使用了0.197 ng维拉帕米剂量。再次检测了通过单次溶剂施用给予的双甲脒和维拉帕米组合以及溶剂对照的效果。所有处理均溶于150 nL丙酮中施用，每个处理组使用10只螨虫。未观察到有螨虫在施用处理、被放置到蛹上之前死亡。该实验于8月19日、21日和28日重复进行。8月19日，每个处理组使用20只螨虫，但由于处理后立即出现死亡，某些处理组使用的螨虫数量最少为19只。8月21日和28日，未观察到有螨虫在施用处理、被放置到蛹上之前死亡，且这两天每个处理组均使用20只螨虫。本实验的所有重复均使用与实验一相同的养蜂场A中的两个蜂群的螨虫，并在处理施用24小时后评估螨虫存活率。
实验三
10月10日，进行了一项实验，以评估季节后期双甲脒与维拉帕米联合使用的毒性。由于养蜂场A中螨虫丰度的波动，本项工作收集的螨虫来自养蜂场B的两个蜂群。处理组包括每只螨虫0.197 ng维拉帕米、每只螨虫0.0468 ng双甲脒以及通过单次溶剂施用共同暴露于0.197 ng维拉帕米和0.0468 ng双甲脒/螨的组。此次，处理溶于300 nL丙酮中施用。为了探究增加的溶剂量对螨虫存活率的潜在影响，我们纳入了两个丙酮对照处理：一个暴露于150 nL，另一个暴露于300 nL。增加溶剂体积是为了缓解在丙酮蒸发前向活体狄斯瓦螨施用更小体积的困难。每个处理组最多使用15只螨虫，但由于处理后立即出现死亡，某些处理组使用的螨虫数量最少为13只。在处理施用24小时后评估螨虫存活率。
实验四
10月22日，对从养蜂场B相同两个蜂群收集的螨虫进行了另一项实验，此次评估了增加剂量的双甲脒与维拉帕米联合使用的效果。处理组包括每只螨虫0.197 ng维拉帕米、每只螨虫0.374 ng双甲脒、通过单次溶剂施用共同暴露于0.197 ng维拉帕米和0.374 ng双甲脒/螨的组以及溶剂对照。所有处理均溶于300 nL丙酮中施用。每个处理组最多使用20只螨虫，但由于处理后立即出现死亡，某些处理组使用的螨虫数量最少为18只。
该实验于10月30日重复进行，使用从相同蜂群收集的螨虫并暴露于相同的处理。每个处理组最多使用17只螨虫，但由于处理后立即出现死亡，某些处理组使用的螨虫数量最少为16只。对于两次重复，均在处理施用24小时和48小时后评估螨虫存活率。测定结束后，收集实验四中存活和死亡的螨虫，并送往位于路易斯安那州巴吞鲁日的美国农业部蜜蜂育种、遗传与生理学研究实验室进行双甲脒抗性基因分型。
双甲脒抗性基因分型
使用装有2.8毫米陶瓷珠的2 mL试管提取单个狄斯瓦螨的基因组DNA，使用Bead Ruptor Elite Mill以4 m/s的速度进行2个循环，每个循环5秒，循环间休息5秒，使用60 μL水作为溶剂。均质化后，样品在1000 x g下离心2分钟，上清液用于TaqMan检测，以检测与狄斯瓦螨中双甲脒抗性相关的β2章鱼胺受体Y215H突变。实验四送交HBBGPRL的所有134只狄斯瓦螨均进行了基因分型。
统计分析
为了增加统计功效，将一个实验中所有重复的存活率数据合并。分别使用Shapiro Wilk检验和Bartlett检验评估正态性和方差齐性。基于这些检验的结果，对所有存活率数据采用非参数方法。使用Kruskal-Wallis秩和检验评估每个处理组螨虫存活比例的差异，并使用Dunn's检验进行事后比较，并进行Benjamini-Hochberg多重比较校正。使用R版本4.4.1创建图表并进行统计分析。所有数据已在补充数据文件S1中提供。
结果
在实验一中，暴露于任何处理24小时后，螨虫存活比例未观察到差异。基于此结果，在实验二中，将最低剂量的双甲脒（0.0117 ng/螨）增加了4倍。暴露于较低剂量维拉帕米（0.197 ng/螨）24小时后存活的螨虫百分比（86.7%）高于较高剂量（0.394 ng/螨，71.4%），尽管存活率的差异在统计学上不显著。为了在维持维拉帕米单独处理螨虫高存活率的同时，实现与维拉帕米最大可能的协同增效作用，后续实验采用了较低剂量。
在实验二中，检测到暴露于处理24小时后，螨虫存活比例存在显著差异，事后检验显示，暴露于0.0468 ng双甲脒与0.197 ng维拉帕米/螨组合的螨虫，其存活率显著低于暴露于溶剂对照或单独维拉帕米的螨虫。
在实验三中，未检测到处理组之间存在显著差异，这表明使用300 nL溶剂不会影响螨虫的存活率。然而，未观察到双甲脒（剂量为实验二中先前测试剂量的1倍和2倍）单独或与维拉帕米联合使用产生任何效应，这表明可能需要更高剂量才能影响10月份从养蜂场B蜂群采集的螨虫的存活率。因此，实验四中将实验三中测试的最高双甲脒剂量增加了8倍。
在处理24小时后，实验四中检测到处理组间螨虫存活比例存在显著差异，但事后检验显示，唯一差异是共同暴露于0.374 ng双甲脒和0.197 ng维拉帕米的螨虫存活比例低于单独暴露于维拉帕米的螨虫。然而，在处理48小时后，再次检测到处理组间存在显著差异。在48小时时，事后检验显示，共同暴露于0.374 ng双甲脒和0.197 ng维拉帕米的螨虫存活比例显著低于所有其他处理组，并且暴露于0.374 ng双甲脒的螨虫存活比例也显著低于对照组和0.197 ng维拉帕米/螨处理组。
受测狄斯瓦螨中，纯合双甲脒抗性基因型的总体百分比为88.5%，且各处理组间的百分比无显著差异。
讨论
在药物转运蛋白研究中，药理学抑制常被用作识别和验证转运蛋白底物的对照方法。维拉帕米作为ABC外排转运蛋白最有效且特征最明确的抑制剂之一，已被成功证明能与不同杀螨剂和杀虫剂协同增强对蜱虫的致死作用，而这些杀螨剂和杀虫剂是已知的ABC转运蛋白底物。确实，在本项针对狄斯瓦螨的研究中，通过双甲脒和维拉帕米的共同暴露，我们证实了它们具有协同致死效应，表明双甲脒是狄斯瓦螨ABC外排转运蛋白的底物，并且可被维拉帕米药理学抑制。在我们的初步实验中，我们未观察到以先前研究发现具有毒性的双甲脒剂量处理螨虫时出现显著死亡率，且添加维拉帕米也未增加死亡率。当以四倍高的双甲脒剂量重复实验时，仅当螨虫共同暴露于维拉帕米时才观察到显著死亡率。在季节后期，当狄斯瓦螨来自不同蜂群时，需要使用相当于初始剂量（0.0117 ng/螨）约32倍的更高剂量才能引发任何效应；然而，在此实验中，直到处理48小时后才观察到显著效应，而非24小时。这与本研究中观察到的非常高的双甲脒抗性基因型水平一致。因此，在使用双甲脒对狄斯瓦螨进行研究时，应考虑从生物测定或基因分型中得出的双甲脒抗性水平，以解释预期结果的差异。
总体而言，本文报告的结果证实，抑制狄斯瓦螨ABC外排转运蛋白可以增加双甲脒的毒性，这可能是通过减少双甲脒的细胞外排实现的。但所需双甲脒剂量的增加表明，我们部分或全部实验中的螨虫可能表现出对双甲脒的抗性。这一点在用于实验四的螨虫中得到了证实，这些螨虫需要约先前报告的双甲脒半数致死剂量28倍的剂量才能引发效应。在测试前，并不清楚被测螨虫是否具有双甲脒抗性，但这些螨虫中有很高比例（88.5%）是抗性基因型的纯合子。然而，即使在
