《Bioorganic Chemistry》：Eupalinolide B prevents cerebral ischemia-reperfusion injury
via the PI3K/Akt/GSK3β(Ser9) signaling pathway
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缺血性卒中（IS）是中国及全球重大公共卫生问题，Eupalinolide B（EB）作为关键活性成分，其通过调控PI3K/Akt/GSK3β(Ser9)信号通路抑制神经元凋亡，改善脑缺血再灌注损伤（CIRI），为新型IS疗法提供证据。
李曼|姜玉欣|薛永康|段远祺|刘亚楠|辛向豪|魏小宇|胡正宇|杨鹏成|刁胜宝|周伟|孙金峰|高丽
教育部长白山天然药物重点实验室，延边大学药学院，中国延吉133002
摘要
缺血性中风（IS）是中国发病率和死亡率的主要原因，也是全球主要的公共卫生问题。Eupalinolide B（EB）是从Eupatorium lindleyanum中提取的主要生物活性成分，具有多种药理活性，尤其在神经退行性疾病中的神经保护作用方面表现突出。然而，EB对脑缺血-再灌注损伤（CIRI）的保护作用的具体机制及其确切的治疗效果尚未完全阐明。本研究通过结合网络药理学分析、PC12细胞体外氧-葡萄糖剥夺/再氧合（OGD/R）模型和小鼠体内大脑中动脉阻塞/再灌注（MCAO/R）模型，系统探讨了EB在CIRI治疗中的潜在靶点和调控网络。研究发现，EB调节了一个由54个核心靶点组成的网络，包括凋亡调节因子（Bcl-2）和PI3K/Akt信号通路成分。体外实验表明，EB显著提高了OGD/R诱导的PC12细胞的存活率，同时减少了细胞内活性氧（ROS）的积累并恢复了线粒体膜电位。体内研究表明，EB激活了MCAO/R小鼠的PI3K/Akt/GSK3β(Ser9)信号通路，从而减轻了神经功能缺损、缩小了脑梗死面积并缓解了神经元病理变化。综上，这些结果表明EB通过激活PI3K/Akt/GSK3β(Ser9)信号通路抑制神经元凋亡，从而对CIRI具有预防作用。这为EB作为新型抗IS疗法提供了有力的实验证据。
引言
从医学角度来看，中风主要分为两种类型：出血性中风和缺血性中风（IS），其中IS约占报告病例的80% [1]。这是一种由多种脑血管损伤原因引起的疾病，导致局部或广泛的脑组织损伤 [2]、[3]。数据显示，IS在致残率、复发率和死亡率方面呈显著上升趋势，逐渐成为威胁中国居民生命和健康的主要因素 [4]。目前，IS的主要临床治疗策略包括药物溶栓和机械取栓，这两种方法都必须在特定的治疗时间窗内进行，以有效溶解血栓、恢复血流并保护缺血半影区。然而，缺血后的血流恢复可能会反加重病理生理变化，包括神经元功能障碍和组织损伤加剧，从而导致脑缺血-再灌注损伤（CIRI） [5]、[6]、[7]。CIRI的发病机制具有高度复杂性和多样性，其特征是活性氧（ROS）产生增加、炎症反应增强、线粒体稳态受损、caspase介导的凋亡以及钙信号传导紊乱 [8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。目前，CIRI的治疗策略包括使用抗氧化剂、抗炎药物和细胞内钙超载抑制剂 [14]、[15]、[16]。然而，这些药物往往具有显著的副作用和有限的疗效，导致治疗效果不理想。因此，迫切需要开发既安全又有效的新型药物来预防和治疗脑缺血损伤。
近年来，中医作为一种潜在且有效的治疗CIRI的方法受到了广泛关注 [17]。与传统疗法不同，中药单体具有独特的药理机制，能够在发挥治疗效果的同时降低毒性和不良反应 [18]。最新研究表明，Eupalinolide B（EB）具有广泛的药理作用，包括抗病毒、抗炎和抗肿瘤活性 [19]、[20]、[21]、[22]，尤其是在神经退行性疾病方面表现出显著的神经保护作用 [23]。最新研究发现，EB能够特异性地靶向并抑制USP7蛋白，从而调节神经炎症反应，并在痴呆和帕金森病动物模型中显示出显著的治疗效果 [24]。然而，目前EB对CIRI的治疗机制及其涉及的分子通路尚未得到系统阐明。
神经元凋亡是CIRI的重要机制。急性脑损伤后，大量局部产生的细胞因子会激活细胞内的凋亡蛋白，通过多种信号传导途径引发细胞死亡 [25]。PI3K/Akt信号通路在细胞中起着关键作用，参与生长、代谢活动、凋亡、肿瘤转移和炎症反应等多种细胞功能。作为关键的抗凋亡和促增殖信号通路，它在多种器官中，尤其是在CIRI中，对缺血-再灌注损伤具有显著的保护作用 [26]、[27]、[28]。PI3K/Akt信号通路的激活会影响许多下游靶点，如B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）和caspase-3，从而促进细胞增殖并抑制凋亡 [29]、[30]。值得注意的是，在CIRI的病理过程中，PI3K/Akt/GSK3β(Ser9)信号通路会受到抑制。研究表明，激活这一通路可以有效减少凋亡并减轻CIRI的严重程度 [31]、[32]、[33]、[34]。
在本研究中，我们利用网络药理学构建了“EB-靶点-CIRI”网络，证明EB是未来IS治疗的潜在候选药物。此外，我们还通过体内和体外CIRI模型探讨了EB的神经保护作用。研究表明，EB通过PI3K/Akt/GSK3β(Ser9)通路发挥保护作用，提高细胞存活率并抑制凋亡，为其作为IS预防和治疗药物的潜力提供了坚实的实验证据。
试剂
Eupalinolide B购自Dester Biotechnology（CAS: 877822–41-8，纯度>98%，中国成都），其HPLC、1H NMR和13C NMR谱图见补充图S1–3。PI3K抑制剂LY294002购自MedChemExpress（CAS: 154447–36-6，纯度>99.86%，中国上海），PI3K抑制剂GDC-0941购自MedChemExpress（CAS: 957054–30-7，纯度>99.77%，中国上海），Edaravone购自Aladdin（CAS: 89–25-8，纯度>99%，中国上海）。DMEM
EB的网络药理学分析
通过网络药理学，我们预测了EB参与调节CIRI的潜在靶点和通路。Venn分析确定了EB和CIRI共有的54个靶点（图1A）。其中，关键靶点包括糖原合成酶激酶-3β（GSK3β(Ser9)）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、环氧化酶-2（PTGS2）和信号转导子和转录激活因子3（STAT3）（补充表S3）。其中，GSK3β(Ser9)表现出
讨论
目前针对CIRI的药物研究进展值得关注 [38]。然而，现有CIRI疗法的临床疗效有限且不良反应显著，这凸显了开发新型预防和治疗CIRI药物的重要性 [39]。在这方面，植物提取的天然产物因其安全性和耐受性而被广泛认可。此外，它们的多靶点和多通路作用越来越受到重视
CRediT作者贡献声明
李曼：撰写初稿、数据可视化、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。
姜玉欣：数据可视化、方法学设计、实验研究、数据分析。
薛永康：数据可视化、方法学设计、实验研究。
段远祺：数据可视化、方法学设计、实验研究。
刘亚楠：数据可视化、方法学设计、实验研究。
辛向豪：实验研究、数据分析、概念构建。
魏小宇：实验研究、数据分析
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：82360683和82360805）和吉林省科技发展计划基金（编号：20260101056JJ）的支持。
