重新利用基于酰胺的药物，揭示了恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）Plasmepsin V酶的抑制机制，从而为抗疟疾治疗提供了新方法

《Bioorganic Chemistry》：Repurposing amide-based drugs unveils inhibition mechanisms of plasmodium falciparum Plasmepsin V enzymatic activity for antimalarial therapy

疟原虫血叶啉裂解酶V（PfPlmV）抑制研究显示，saquinavir通过结合催化二联体Asp118/Asp365产生强抑制（IC50 0.35±0.01 μM），5-FU和favipiravir因结合位点和结构差异呈现弱抑制或非抑制性结合。该研究为药物重定位开发PfPlmV特异性抗疟剂提供结构-活性关系依据。

　　

阿尼塔德维·K·普拉贾帕蒂（Anitadevi K. Prajapati）、加里玛·辛格（Garima Singh）、马努·洛普斯（Manu Lopus）和辛詹·乔杜里（Sinjan Choudhary）

印度孟买大学基础科学卓越中心（UM-DAE Centre for Excellence in Basic Sciences），维迪亚纳加里校区（Vidyanagari Campus），卡利纳（Kalina），孟买400098

摘要

了解酶在分子水平上是如何被抑制的，对于设计针对疟原虫的合理药物至关重要。恶性疟原虫的Plasmepsin V（PfPlmV）是一种天冬氨酸蛋白酶，对于将寄生虫蛋白输出到宿主红细胞中至关重要，已成为抗疟治疗的强大靶点。在这项研究中，我们调查了三种已批准的酰胺类药物——法维匹拉韦（favipiravir）、5-氟尿嘧啶（5-FU）和沙奎那韦（saquinavir）是否能够抑制PfPlmV的催化活性。这三种化合物都与PfPlmV结合，亲和力约为10⁴ M^?1，但结合行为各不相同。等温滴定量热法（ITC）显示，氢键和疏水相互作用都参与了这一过程，从而稳定了酶-药物复合物。酶动力学和对接研究表明，抑制效果取决于催化裂隙的覆盖程度。结果表明，沙奎那韦与关键活性位点残基相互作用，包括催化二聚体Asp118和Asp365，其竞争性抑制的IC₅₀值为0.35 ± 0.01 μM，Ki值为（0.14 ± 0.02）μM。5-FU仅与Asp118附近结合，导致混合类型的抑制，IC₅₀和Ki值较高。法维匹拉韦则结合在裂隙的边缘，不参与催化二聚体的作用，因此表现为弱的非抑制性结合剂。本研究获得的关于相互作用-结构-抑制活性的见解，可能为开发选择性强的PfPlmV抑制剂/抗疟药物提供指导。

引言

疟疾仍然是流行地区最严重的传染病之一。尽管全球有许多旨在控制和根除疟疾的努力，但新发疟疾病例的减少速度低于预期[1]。虽然近年来疟疾病例总体有所下降，但出现了两个令人担忧的趋势：（i）尽管采取了各种措施来遏制疟疾的传播，疟疾病例仍有所回升；（ii）多重耐药恶性疟原虫（Pf）菌株的出现[2]。这些不断变化的挑战凸显了寻找新的抗疟靶点以及开发创新治疗药物的迫切需求。在人类红细胞（RBCs）内，恶性疟原虫驻留在寄生泡中，并通过胞口摄取血红蛋白，将其输送到酸性消化泡中[3]，[4]。它还输出能够改变红细胞结构和功能的蛋白质，这对疟原虫的生存和毒力至关重要[4]，[5]。这种血红蛋白的消化以及红细胞结构和功能的改变是由一类称为plasmepsins（Plms）的天冬氨酸蛋白酶介导的[6]。在10种不同的Plms中，PlmI、II、IV和histo-天冬氨酸蛋白酶（HAP）对血红蛋白的分解起关键作用[7]，[8]。PlmV是一种特定位于内质网的天冬氨酸蛋白酶，在无性和配子细胞生成阶段对蛋白质的输出至关重要，因此由于其在该过程中的关键作用，它成为有前景的传播阻断靶点[9]。恶性疟原虫的Plasmepsin V（PfPlmV）是一个重要的抗疟药物靶点，因为它参与了寄生虫内质网中保守的PEXEL（Plasmodium Export Element）基序（RxLxE/Q/D）的处理[10]，[11]，[12]。这种切割由催化残基Asp118和Asp365介导，使效应蛋白得以输出，从而重塑宿主红细胞以支持寄生虫的生存[13]。通过突变或抑制这种处理会破坏蛋白质的输出，减少寄生虫的生长，从而证实了PfPlmV在协调寄生虫生长和发育中的关键作用[14]，[15]。重要的是，由于PfPlmV控制着一条独特且不可或缺的途径，不同于现有的药物靶点，因此抑制它提供了一种克服抗疟药物耐药性的有希望的策略。靶向PfPlmV不仅可以抑制寄生虫的生存，还可以通过限制寄生虫的适应能力来防止耐药性的产生，而不影响其生存能力，使其成为治疗和阻断传播的强大候选药物[16]，[17]。此外，它的非冗余作用、在人体中的不存在以及对寄生虫生存的关键重要性，使其成为抗疟药物开发的高度特异性和有吸引力的靶点。另外，由于PfPlmV是一种高度保守的酶（在3D7和Dd2之间序列同一性达到99–100%），因此重组PfPlmV的抑制或结合提供了独立于菌株的生化活性指标。此外，PfPlmV并未涉及已知的多重耐药机制（主要涉及< />、pfmdr1、kelch13），这支持了独立于寄生虫菌株背景的生化测定的相关性[14]，[17]。

我们的研究重点关注针对PfPlmV的酰胺类药物。PfPlmV是恶性疟原虫中的一种关键蛋白酶[18]，[19]。本研究中选择酰胺类药物法维匹拉韦、5-氟尿嘧啶和沙奎那韦，并不仅仅基于它们含有酰胺或酰胺相关功能基团，而是一种理性的再利用策略，旨在探究化学结构不同的酰胺类骨架如何与PfPlmV的催化裂隙相互作用。有效抑制PfPlmV需要氢键和静电相互作用的协同作用，以及沿着底物结合裂隙和瓣区的广泛疏水相互作用[20]。虽然极性相互作用对于特异性和催化破坏至关重要，但疏水接触对于稳定抑制剂结合和实现高抑制效力也非常关键[21]。通过有意选择在分子大小、构象灵活性和空间体积上差异显著的化合物，本研究能够对有效抑制的结构要求进行比较评估[22]。结果清楚地表明，仅仅具有酰胺功能不足以抑制PfPlmV；相反，有效抑制需要（i）同时结合两个催化天冬氨酸残基（Asp118和Asp365），（ii）足够的分子长度以跨越催化裂隙，以及（iii）适当的定位以便与稳定抑制剂-酶复合物的瓣区残基相互作用[23]，[24]。此外，药物再利用利用了已知安全性的批准药物，加速了有效治疗的开发，特别是在应对新兴的抗疟耐药性方面[25]，[26]。我们探讨了三种酰胺类药物的潜力：抗病毒药物法维匹拉韦、抗癌药物5-氟尿嘧啶（5-FU）和HIV蛋白酶抑制剂沙奎那韦，以抑制PfPlmV介导的蛋白质处理和输出，提供了一种新的策略来破坏寄生虫的生存和疾病进展。法维匹拉韦是一种核苷类似物，最初用于治疗对传统抗病毒药物具有抗性的流感病毒[27]。它通过靶向RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）来发挥作用，该酶对RNA病毒的复制至关重要。它对埃博拉、拉沙（急性病毒性出血热）和SARS-CoV-2具有广谱抗病毒活性[28]。此外，5-FU是一种化疗抗代谢物，自20世纪60年代以来被广泛用于治疗多种癌症，包括结直肠癌、乳腺癌和胃肠道癌。它通过抑制胸苷酸合成酶来发挥作用，该酶是DNA合成的关键酶，从而阻止胸苷的产生并干扰细胞增殖[29]。第三种药物沙奎那韦是一种抗逆转录病毒药物，是最早开发的用于治疗HIV/AIDS的蛋白酶抑制剂之一。沙奎那韦通过与HIV-1蛋白酶活性位点结合，阻止病毒多聚蛋白切割成功能性蛋白质[30]，[31]。这一作用阻止了成熟病毒颗粒的形成，减少了患者体内的病毒载量[32]。本研究通过临床批准的酰胺类药物表征了PfPlmV的生化和生物物理抑制作用，验证了其作为酶靶点的有效性，独立于寄生虫生长或哺乳动物细胞毒性测定。关于这些药物的选择性和细胞毒性，文献表明这些药物表现出有利的到中等的细胞毒性谱。法维匹拉韦未显示出抗疟或抗plasmepsin活性，在Vero E6细胞（哺乳动物细胞系）中的半最大有效浓度（EC₅₀）约为61.9 μM，细胞毒性浓度（CC₅₀）大于400 μM，在人类肝癌细胞系HepG2细胞中的细胞毒性较低（>300 μM），选择性指数（SI）大于6[33]。5-FU对P. falciparum的抑制作用可以忽略不计，在哺乳动物癌细胞系中的IC₅₀约为1–40 μM，在HepG2细胞中的CC₅₀约为30–50 μM，SI小于1[29]。据报道，沙奎那韦可以抑制PfPM II和PfPM IV，在HepG2细胞中的IC₅₀约为8–15 μM，CC₅₀为25–50 μM，SI约为2，预测其与PfPM V/X活性位点的结合[24]。将这些药物/抑制剂重新用于抑制PfPlmV的催化活性，可以通过阻断蛋白质的输出从而有效破坏疟原虫的生存，进而阻止寄生虫在人类红细胞中的重塑（如图1所示）。这种方法可能导致有效的疟疾治疗，特别是与其他抗疟药物联合使用时，可以增强疗效并减少耐药性的产生。

基于这一背景，我们使用荧光光谱研究了酰胺类药物法维匹拉韦、5-FU和沙奎那韦与PfPlmV的结合相互作用。通过高灵敏度的等温滴定量热法（ITC）获得了关于PfPlmV-药物相互作用的详细见解，并通过分子对接研究获得的残基级信息进一步证实了这些见解。还使用热熔解测定评估了每种药物对PfPlmV过渡态稳定性的影响。此外，使用含有PEXEL基序的荧光肽进行了详细的酶动力学测定，以评估药物的抑制效力并了解每种化合物对PfPlmV活性的抑制机制。本质上，将这些物理化学见解与结构-活性关系研究相结合，提供了关于通过重新利用法维匹拉韦、5-FU和沙奎那韦抑制PfPlmV活性的机制性见解。这些机制性见解对于开发具有增强疗效、安全性和抗耐药性的选择性抗疟药物至关重要。

材料

用于表达和纯化PfPlmV的所有试剂均为高分析纯度，纯度超过98%。通用实验室化学品来自Sigma-Aldrich。5-FU和Saquinavir mesylate来自Sigma Aldrich，法维匹拉韦购自Tokyo Chemical Industry (India) Pvt. Ltd.，纯度均超过98%，它们的化学结构如图1所示。用于纯化的镍-硝基三乙酸（Ni-NTA）琼脂糖珠（>98%）

针对人类天冬氨酸蛋白酶的选择性多重序列比对

Plasmepsin V（PfPlmV）在Plasmodium天冬氨酸蛋白酶中是独一无二的，执行着将PEXEL基序切割以将寄生虫蛋白输出到宿主红细胞中的独特且必要的功能[50]。与其他参与血红蛋白降解的Plasmepsins不同，PfPlmV的作用对寄生虫的生存至关重要，其独特的底物特异性和独特的活性位点使其在结构和功能上与其他Plasmodium plasmepsins和人类天冬氨酸蛋白酶不同

结论

在这项研究中，我们采用了一种药物再利用方法来研究临床批准的酰胺类药物法维匹拉韦、5-FU和沙奎那韦对恶性疟原虫 Plasmepsin V（PfPlmV）的抑制潜力，PfPlmV是一种对寄生虫生存至关重要的蛋白酶。成功表达了具有催化活性的重组PfPlmV，并对其进行了全面的生物物理和生化分析，提供了关于药物结合和酶抑制的机制性见解。

CRediT作者贡献声明

阿尼塔德维·K·普拉贾帕蒂（Anitadevi K. Prajapati）：撰写——原始草稿，验证，方法学，调查，正式分析，数据管理。加里玛·辛格（Garima Singh）：撰写——原始草稿，方法学，正式分析，数据管理。马努·洛普斯（Manu Lopus）：撰写——审阅与编辑，监督，概念化。辛詹·乔杜里（Sinjan Choudhary）：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理，资金获取，正式分析，概念化。

未引用的参考文献

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利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢科学技术部——科学与工程研究委员会（DST-SERB；授权号CRG/2019/000267）提供的财政支持，并感谢孟买基础科学卓越中心（UM-DAE Centre for Excellence in Basic Sciences）提供的必要基础设施。