《European Journal of Medicinal Chemistry》：A Strategy for Improving Blood?Brain Barrier Permeability of ChE Inhibitors Through Blood-Brain Barrier (BBB) Transporter
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本研究设计并合成了靶向血脑屏障（BBB）转运体的托克瑞宁衍生物，通过四乙基铵基团靶向胆碱转运体（CHT）和氨基酸片段靶向L-型氨基酸转运体1（LAT1），显著提高药物渗透性。实验证实化合物C4的渗透系数（Papp）显著高于托克瑞宁，而L3通过LAT1介导的主动转运实现高效脑内递送，为中枢神经药物开发提供新策略。
高子明|胡彦玉|郑娜|王清华|谢晨龙|陈梦晓|叶阿斯里姆·桑齐达|王兰|张天宇|贾志波|孙鹏坤|李亚宁|徐春雷|赵群|吴玉兰|陈瑶|孙浩鹏
中国药科大学药学院，南京，211198，中华人民共和国
摘要
克服血脑屏障（BBB）仍然是中枢神经系统（CNS）药物开发中的一个关键挑战。本文提出了一种基于BBB内源性转运蛋白的主动靶向策略，具体是通过合理设计新型塔克林衍生物实现的。本研究首次设计和合成了两个新型的塔克林衍生物系列，这些衍生物通过引入一个靶向胆碱转运蛋白的季铵基团和一个靶向L型氨基酸转运蛋白1（LAT1）的氨基酸片段来实现。这些化合物对乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）均表现出强抑制活性。使用体外BBB模型（bEnd.3细胞）实验，化合物C4的表观渗透系数（Papp）显著高于塔克林（分别为（19.58 ± 1.17）× 10^-6 cm·s^-1 vs （13.41 ± 0.58）× 10^-6 cm·s^-1），表明其BBB穿透能力增强。有趣的是，化合物L3在体外的Papp值与塔克林相似（（11.25 ± 3.12）× 10^-6 cm·s^-1），但在随后的体内实验中表现出异常高的脑部暴露量。其较差的被动扩散性（通过平行人工膜渗透性测定和低脂溶性证实）表明其转运过程可能涉及LAT1介导的主动转运途径。此外，竞争性抑制实验表明，化合物L3和C4的转运特异性分别由LAT1和CHT介导。诱导契合分子对接实验进一步验证了L3对LAT1的高亲和力。总之，这项工作不仅提供了具有高BBB渗透性的先导化合物，还加深了我们对利用内源性转运蛋白进行脑靶向递送的理解，为开发新的CNS治疗药物奠定了坚实基础。
引言
在针对中枢神经系统（CNS）相关疾病的药物开发过程中，必须克服的最大挑战之一是药物能否成功进入CNS。因此，如何穿越血脑屏障（BBB）已成为中枢神经系统药物开发中的主要难题[1]。BBB是血液与大脑之间形成的可渗透屏障，由相邻内皮细胞之间的复杂连接网络构成[2]，它限制了亲水性物质、带电分子、蛋白质和肽进入大脑，并在维持脑神经组织细胞外微环境的稳态及保护CNS免受药物神经毒性方面起着重要作用[3]。然而，这一生理屏障也有效阻挡了约98%的小分子药物和几乎100%的大分子药物在大脑中发挥治疗效果，从而增加了中枢神经系统药物开发的难度[4]。
膜转运蛋白是一类功能性蛋白质，负责在细胞膜之间或细胞内的不同亚细胞器之间介导药物或其他底物的跨膜转运。药物转运蛋白广泛分布于人体的各种组织和器官中，参与药物的吸收、分布、代谢和排泄，影响药物的生物利用度、靶向递送能力和毒性副作用[5]。例如，据估计，转运蛋白占神经血管单元中所有蛋白质的10-15%。根据转运方向和机制，药物转运蛋白可分为两类：一类是利用细胞膜两侧的离子浓度梯度或电位差作为驱动力，促进药物从细胞外进入细胞或从细胞内排出到细胞外，属于可溶性载体（SLC）超家族，也称为摄取或次级主动转运蛋白[6]；另一类是利用ATP水解提供的能量进行底物跨膜转运，促进药物从细胞内排出到细胞外或从一个亚细胞器转移到另一个亚细胞器，属于ATP结合盒（ABC）超家族，也称为外排或初级主动转运蛋白[7]。
在BBB表达的转运蛋白已被研究作为有效的药物载体，用于药物进入大脑。氨基酸转运蛋白和胆碱转运蛋白是药物进入大脑过程中的两种重要转运蛋白。LAT1是BBB上最丰富的中性氨基酸转运蛋白之一，对维持大脑氨基酸稳态和营养供应至关重要。其底物选择性（尤其是对含有芳香环的疏水性大侧链氨基酸的亲和力）与塔克林具有某些结构相似性，这为通过氨基酸连接子合理设计前体药物提供了结构基础。更重要的是，LAT1已被广泛研究并证实是许多中枢神经系统药物脑递送的关键通道。例如（图1-A），左旋多巴、巴氯芬、美法仑、加巴喷丁和普瑞巴林都是通过L型氨基酸转运蛋白1（LAT1）到达大脑靶点的[8-12]。CHT是BBB上的一种特异性高亲和力胆碱转运蛋白，负责将胆碱从外周运输到大脑以合成乙酰胆碱。靶向CHT可以利用其天然的高脑摄取效率。李等人选择了高胆碱转运蛋白亲和力的胆碱衍生物作为BBB和GBM的双靶向配体[13]。如图1-B所示，王等人通过将胆碱类似物与抗程序性死亡配体1（anti-Pd-L1）通过pH敏感连接子结合，制备出具有显著改善BBB渗透性的聚合物[14]。李等人使用由胆碱转运蛋白设计的胆碱靶向纳米颗粒修饰的质粒DNA，在体内实现了更高的基因分布和表达[15]。本研究旨在增强胆碱能系统功能以治疗阿尔茨海默病，选择CHT作为靶点可以实现“同路径递送”——将药物精确输送到需要增强胆碱能传递的病变区域。因此，利用胆碱和氨基酸转运蛋白通常被认为对于高效脑递送具有很大潜力。
塔克林是一种常见的胆碱酯酶抑制剂，1993年获得FDA批准用于治疗轻度至中度阿尔茨海默病（AD）[16]。然而，后续的一系列临床试验表明塔克林可能导致严重的肝损伤和胃肠道副作用，导致其于2013年失去批准并在临床治疗中停止使用[17]。因此，目前对塔克林的研究集中在提高其胆碱酯酶活性或降低肝毒性方面。本文旨在将塔克林作为工具分子，并将其与转运蛋白结合，以获得具有高BBB渗透性的抗AD药物，从而降低其肝毒性。
因此，本研究旨在合理利用LAT1或CHT等内源性转运系统，显著提高药物的脑部暴露量。这可能为未来面临脑递送挑战的各种有前景的药物候选物提供一种通用解决方案，有助于解决阿尔茨海默病和其他CNS疾病的治疗难题。
结果与讨论
化合物设计与合成。LAT1在BBB中广泛存在，能够将色氨酸等神经递质前体从血液转运到大脑[18, 19]，其转运效率明显优于其他氨基酸、葡萄糖、有机阳离子/阴离子、胆碱和单羧酸转运蛋白。L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸和L-苏氨酸等氨基酸类似物是LAT1最理想的转运底物[20]
结论
总之，本研究通过利用BBB上高表达的转运蛋白（如胆碱转运蛋白和LAT1氨基酸转运蛋白），成功开发了两系列新型的、针对中枢系统的塔克林衍生物，旨在提高大脑中的药物浓度同时降低外周毒性。这是通过将塔克林与季铵基团结合实现的
通用信息
所有试剂和溶剂均来自商业渠道购买，除非另有说明，否则无需进一步纯化。所有化学结构均通过1H和13C核磁共振（NMR）光谱及高分辨率质谱（ESI-HRMS）进行了确认。1H和13C NMR光谱使用四甲基硅烷（TMS）作为内标，在Bruker BioSpin GmbH光谱仪上以300 MHz的CD3OD和DMSO-d6条件下记录。ESI-HRMS在Agilent LC/DAD/MSD上记录。
作者贡献声明
陈梦晓：研究、数据整理。
孙浩鹏：指导、资金获取、概念构思。
陈瑶：指导、资金获取、概念构思。
谢晨龙：研究、数据整理。
吴玉兰：写作——审稿与编辑。
王清华：验证、软件应用、研究。
赵群：写作——审稿与编辑。
郑娜：写作——初稿撰写、可视化、验证、项目管理、方法学设计、数据整理。
张天宇：写作——审稿
未引用参考文献
[8], [9], [10], [11], [12], [18], [19], [21], [22], [23]
注释
作者声明没有竞争性财务利益。
利益冲突声明
所有作者声明与提交给《欧洲药物化学杂志》（European Journal of Medicinal Chemistry）的论文“通过血脑屏障（BBB）转运蛋白提高胆碱酯酶抑制剂渗透性的策略”（A Strategy for Improving Blood?Brain Barrier Permeability of ChE Inhibitors Through Blood-Brain Barrier (BBB)）无关的利益冲突。
致谢
我们衷心感谢国家自然科学基金（项目编号82473781、22467009）和江苏省自然科学基金（项目编号BK20221522）的支持，同时也感谢江苏省“333高层次人才培养”计划（2022-3-16-203）的资助。
