以Rac1为靶点的咔唑-嘧啶类化合物的设计、合成及其作为定向抗疟药物的生物学评估

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Design, synthesis and biological evaluation of Rac1-targeting carbazole–pyrimidines as host-directed antimalarials

抗疟疾药物开发中基于宿主Rac1蛋白的EHop-016衍生物设计合成及活性研究，通过系统结构修饰发现化合物11和5e对氯喹敏感及耐药疟原虫株均有效，且具有高选择性和抑制全周期发育的特性。

　　

西尔维娅·帕拉皮尼（Silvia Parapini）| 萨拉·达莱桑德罗（Sarah D’Alessandro）| 萨拉·特拉瓦格里奥内（Sara Travaglione）| 西尔维奥·帕奥内（Silvio Paone）| 伊莱亚内克西斯·M·马德拉·奎瓦斯（Ileanexis M. Madera Cuevas）| 特蕾莎·迪波尔（Teresa Dipol）| 戴维·温迪亚姆·拉乌尔·宗戈（Davy Wendyam Raoul Zongo）| 安娜·M·菲格罗亚·瓦兹克斯（Ana M. Figueroa Vazquez）| 奥内拉·莫尔西利（Ornella Morsilli）| 亚历西亚·法布里（Alessia Fabbri）| 科内利斯·P·弗拉尔（Cornelis P. Vlaar）| 安娜·奥利维耶里（Anna Olivieri）

米兰大学健康生物医学科学系，帕斯卡尔街36号，20133米兰，意大利

摘要

以宿主为导向的疗法代表了一种新兴策略，通过针对对疟原虫生存至关重要的宿主因子来克服抗疟疾药物的耐药性。小GTP酶Rac1是唯一存在于成熟人类红细胞中的Rac蛋白，此前已被确定为支持恶性疟原虫在红细胞内发育的关键宿主因子。基于已知的Rac1抑制剂EHop-016（在先前的研究中显示出良好的抗疟原虫活性），我们设计并合成了一系列咔唑-嘧啶类似物，以寻找具有更高效力和选择性的衍生物。

替换嘧啶核心后得到了无活性的化合物，这证明了嘧啶核心的关键作用。对嘧啶环上2位、5位和6位的系统化学修饰表明，电子和空间因素都对抗疟原虫活性有重要影响。几种衍生物对氯喹敏感的D10株和氯喹耐药的W2株恶性疟原虫显示出亚微摩尔级的抑制浓度。我们在人类细胞上评估了它们的细胞毒性，以确定选择性指数。根据这些结果，选择了五种化合物来验证其在上皮细胞中对Rac1的抑制作用。其中，化合物11和5e作为候选分子脱颖而出，其对D10寄生虫的IC₅₀值分别为46.6 nM和76.0 nM，选择性指数均大于45。与EHop-016相比，这两种化合物的效力（IC₅₀ < 250 nM）和选择性均有所提高。阶段特异性分析显示，这两种化合物在整个红细胞内发育周期中都表现出抗疟原虫活性。

这些发现进一步验证了Rac1作为抗疟疾疗法的潜在宿主靶点，并确定了新的EHop-016衍生物作为开发以宿主为导向的抗疟疾药物的有希望的框架。

引言

疟疾是全球最致命的疾病之一，2024年报告了超过2.82亿病例和61万人死亡，主要发生在五岁以下的儿童中[1]。

抗击疟疾面临的最紧迫挑战之一是药物耐药性；到目前为止，已经出现了对所有可用抗疟疾药物类别都具有耐药性的寄生虫株。因此，识别新的药理靶点并发现具有抗疟原虫活性的新化合物是一项紧迫且高度相关的科学优先事项[2]，[3]。

疟疾是由疟原虫属的单细胞寄生虫引起的，这些寄生虫通过受感染蚊子的叮咬传播给人类。导致大多数疟疾相关死亡的物种是恶性疟原虫。这种寄生虫在蚊子体内进行有性繁殖，在人体内进行无性繁殖。在肝脏中的初始繁殖周期之后，侵袭性的寄生虫形式——称为裂殖子——进入人体红细胞，在那里生长和成熟，然后通过裂殖作用进行繁殖。当裂殖子成熟时，宿主红细胞破裂，释放新的侵袭性裂殖子进入血液，准备感染更多的红细胞。

一种限制药物耐药性发展的新兴策略是针对宿主而不是病原体。细胞内病原体依赖于宿主因子来侵入细胞并在其他不利环境中生存。虽然针对病原体的药物可能因病原体基因组中的单个突变而失效，但绕过宿主因子的缺失通常需要病原体感染策略的重大调整。此外，以宿主为靶点的疗法更有可能对同一病原体的不同株以及可能的多种物种有效[4]，[5]，[6]，[7]。一些以宿主为靶点的分子已被证明对包括登革热和结核病在内的多种传染病的致病因子有效[8]，[9]，[10]，并且一些化合物已成功用于临床治疗，例如丙型肝炎和艾滋病的治疗[11]，[12]。

人类GTP酶Rac1参与了依赖于肌动蛋白调节的各种细胞过程的信号传导，包括细胞迁移、细胞分裂[13]，以及对于本研究最重要的是，细胞内病原体对宿主细胞的侵入[14]。Rac1作为一个分子开关，在非活性GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。其激活由鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）控制，这些因子促进GDP的释放并允许GTP结合；GTP酶激活蛋白（GAPs）加速GTP水解，使Rac1恢复到非活性状态；以及鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂（GDIs），这些抑制剂将Rac1隔离在细胞质中并阻止其激活。

几种细胞内细菌，如金黄色葡萄球菌 [15]、鼠伤寒沙门氏菌 [16]以及许多其他细菌[17]，[18]，[19]，[20]，能够激活宿主细胞中的Rac1，从而促进肌动蛋白的重塑，便于寄生虫的内化。

Rac1还在细胞内寄生虫（如克鲁兹锥虫 [21]、杜诺万利什曼原虫 [22]和弓形虫 [23]）的侵入过程中发挥关键作用，后者与疟疾寄生虫恶性疟原虫属于同一门。

在弓形虫中，Rac1被主动招募到寄生虫吞噬泡中，即包围寄生虫的膜中，通过使用显性负突变或RNA干扰来破坏其功能可以显著减少寄生虫的侵入[23]。

因此，Rac1是一个非常有前景的宿主靶点候选物，用于抗疟疾疗法，并为开发以宿主为导向的抗疟疾药物提供了新的框架。

引言

疟疾是全球最致命的疾病之一，2024年报告了超过2.82亿病例和61万人死亡，其中大多数是五岁以下的儿童[1]。

抗击疟疾最紧迫的挑战之一是药物耐药性；到目前为止，已经出现了对所有可用抗疟疾药物类别都具有耐药性的寄生虫株。因此，识别新的药理靶点并发现具有抗疟原虫活性的新化合物是一项紧迫且高度相关的科学优先事项[2]，[3]。

疟疾是由疟原虫属的单细胞寄生虫引起的，这些寄生虫通过受感染蚊子的叮咬传播给人类。导致大多数疟疾相关死亡的物种是恶性疟原虫。这种寄生虫在蚊子体内进行有性繁殖，在人体内进行无性繁殖。在肝脏中的初始繁殖周期之后，侵袭性的寄生虫形式——称为裂殖子——进入人体红细胞，在那里生长和成熟，然后通过裂殖作用进行繁殖。当裂殖子成熟时，宿主红细胞破裂，释放新的侵袭性裂殖子进入血液，准备感染更多的红细胞。

一种限制药物耐药性发展的新兴策略是针对宿主而不是病原体。细胞内病原体依赖宿主因子来侵入细胞并在其他不利环境中生存。虽然针对病原体的药物可能因病原体基因组中的单个突变而失效，但绕过宿主因子的缺失通常需要病原体感染策略的重大调整。此外，以宿主为靶点的疗法更有可能对同一病原体的不同株以及可能的多种物种有效[4]，[5]，[6]，[7]。一些以宿主为靶点的分子已被证明对包括登革热和结核病在内的各种传染病的致病因子有效[8]，[9]，[10]，并且一些化合物已经成功用于临床治疗，例如丙型肝炎和艾滋病的治疗[11]，[12]。

人类GTP酶Rac1参与了依赖于肌动蛋白调节的各种细胞过程的信号传导，包括细胞迁移、细胞分裂[13]，以及对于本研究最重要的是，细胞内病原体对宿主细胞的侵入[14]。Rac1作为一个分子开关，在非活性GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。其激活由鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）控制，这些因子促进GDP的释放并允许GTP结合；GTP酶激活蛋白（GAPs）加速GTP水解，使Rac1恢复到非活性状态；以及鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂（GDIs），这些抑制剂将Rac1隔离在细胞质中并防止其激活。

几种细胞内细菌，如金黄色葡萄球菌 [15]、鼠伤寒沙门氏菌 [16]以及其他许多细菌[17]，[18]，[19]，[20]，能够激活宿主细胞中的Rac1，从而促进肌动蛋白的重塑，便于寄生虫的内化。

Rac1还在细胞内寄生虫（如克鲁兹锥虫 [21]、杜诺万利什曼原虫 [22]和弓形虫 [23]的侵入过程中发挥关键作用，后者与疟疾寄生虫恶性疟原虫属于同一门。

在弓形虫中，Rac1被主动招募到寄生虫吞噬泡中，即包围寄生虫的膜中，通过使用显性负突变或RNA干扰来破坏其功能可以显著减少寄生虫的侵入[23]。

因此，Rac1是一个非常有前景的宿主靶点候选物，作为药理靶点具有多种优势。由于其在各种类型癌症中的转移形成中的作用，Rac1已被广泛研究，已有超过10,000篇科学文章发表关于这种蛋白质。几种特定的Rac1抑制剂已经上市[24]，[25]，[26]，[27]；其中一些已经在体内进行了测试[28]。此外，Rac1及其几个相互作用物的晶体结构已经被解析，这对于合理设计和开发新的抑制剂非常有价值[29]。

先前的蛋白质组学分析确定Rac1是成熟人类红细胞中唯一存在的Rac GTP酶亚家族成员（http://rbcc.hegelab.org）。这一发现通过Western blot分析得到了进一步验证，该分析确认了红细胞膜中存在Rac1而不存在Rac2[30]。

我们小组之前发表的两项研究表明，Rac1在恶性疟原虫的红细胞感染中起着关键作用。通过使用两种特定的Rac1抑制剂，我们证明了这种GTP酶参与了侵入过程和寄生虫的细胞内发育[30]。此外，还在恶性疟原虫培养物上测试了一系列市售的Rac1抑制剂。十二种具有不同化学结构和作用机制的化合物表现出抗疟原虫活性，其中三种最有效的化合物的IC₅₀值低于1 μM[31]。最有效的化合物是EHop-016，其对氯喹敏感的恶性疟原虫 D10株的IC₅₀值为138 ± 16 nM，对氯喹耐药的W2株的IC₅₀值为322 ± 29 nM。此外，其选择性指数（SI）为37.8[31]。EHop-016最初是作为抗肿瘤剂研究的，在体外和体内研究中均表现出良好的安全性[28]，[32]。EHop-016在体外中的抗疟原虫活性为其作为潜在抗疟疾药物的分子类别提供了强有力的概念证明。

在这项研究中，我们设计了一系列基于EHop-016的结构类似物，并评估了它们抑制Rac1的效力以及作为抗疟疾药物的潜力。通过全面的生化和生物学测定，我们旨在识别具有更高效力和选择性的新化合物，最终为开发更有效的抗疟疾药物做出贡献。

化合物合成

化学构建块来自Millipore-Sigma（美国密苏里州圣路易斯），溶剂来自Fisher Scientific（美国）。对于需要微波辐射加热的反应，使用了配备10 mL密封压力管的CEM Discover Microwave合成器。NMR光谱是在500 MHz Bruker Avance III光谱仪上记录的。¹H和¹³C NMR分析以及每种产品的光谱都包含在补充数据中。化合物3a-h和5a-h是在

化学

新型（9-乙基-9H-咔唑-3-基）-嘧啶衍生物的合成方法类似于EHop-016的合成方法，如方案1所示。先前的研究表明咔唑基团（红色片段）对Rac抑制活性有显著贡献，因此保持不变。在第一步中，市售的各种取代的二氯嘧啶1与9-乙基-9H-咔唑-3-胺2在异

讨论

在这项研究中，我们报告了一系列基于已知Rac1抑制剂EHop-016结构的新衍生物的设计、合成和生物学特性，目的是识别对恶性疟原虫具有更高效力且对哺乳动物细胞毒性较低的化合物。系统的结构修饰表明，嘧啶核心上的特定取代显著影响了这些分子的生物学特性，从而识别出两种

CRediT作者贡献声明

戴维·温迪亚姆·拉乌尔·宗戈（Davy Wendyam Raoul Zongo）：研究。特蕾莎·迪波尔（Teresa Dipol）：研究。伊莱亚内克西斯·M·马德拉·奎瓦斯（Ileanexis M. Madera Cuevas）：研究。西尔维奥·帕奥内（Silvio Paone）：研究。安娜·奥利维耶里（Anna Olivieri）：撰写——原始草稿，研究，资金获取，概念化。亚历西亚·法布里（Alessia Fabbri）：撰写——原始草稿，监督，资金获取。奥内拉·莫尔西利（Ornella Morsilli）：方法学。安娜·M·菲格罗亚·瓦兹克斯（Ana M. Figueroa Vazquez）：研究。萨拉·达莱桑德罗（Sarah D’Alessandro）：撰写——原始草稿，研究。西尔维娅·帕拉皮尼（Silvia Parapini）：撰写——原始草稿，

资金来源

这项工作得到了Fondo di Beneficenza – Intesa Sanpaolo（项目抑制人类GTP酶Rac1：一种新的抗疟疾药物开发策略）和意大利高等卫生研究院（Istituto Superiore di Sanità）（意大利-非洲博士资助计划，项目高通量筛选参与恶性疟原虫侵入敏感性的红细胞因子）的支持，后者还资助了戴维·宗戈的工资。美国国立卫生研究院（NIH/NIGMS 5R16GM153660（也资助了CPV）也提供了支持。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Cornelis P Vlaar报告称获得了美国国立卫生研究院NIGMS 5R16GM153660的财务支持。安娜·奥利维耶里报告称获得了Fondo di Beneficenza - Intesa Sanpaolo的财务支持。安娜·奥利维耶里报告称获得了意大利高等卫生研究院的财务支持。戴维·宗戈报告称获得了意大利高等卫生研究院的财务支持。