针对CD44的壳聚糖纳米颗粒递送人参皂苷Rg1，通过AMPK/mTOR介导的自噬和焦亡调控机制恢复糖尿病肾病的线粒体稳态

《Free Radical Biology and Medicine》：CD44-Targeted Chitosan Nanoparticles Delivering Ginsenoside Rg1 Restore Mitochondrial Homeostasis in Diabetic Kidney Disease via AMPK/mTOR-Mediated Regulation of Autophagy and Pyroptosis

糖尿病肾病肾小管上皮细胞损伤机制及靶向纳米递送系统研究；

　　

余如翠|张燕|吴瑞英|徐静薇

中国科学技术大学第一附属医院中医科，中国科学院大学生命科学与医学部，合肥230001，中国

摘要

目的

线粒体功能障碍和细胞死亡失调是糖尿病肾病（DKD）进展的关键驱动因素。本研究旨在构建一种以CD44为靶点的壳聚糖（Cs）纳米颗粒，其中包裹了人参皂苷Rg1（CD44-Cs@Rg1），以实现靶向递送，并评估其在DKD中调节自噬、焦亡和线粒体功能的能力。

方法

采用共价修饰策略合成了CD44-Cs@Rg1纳米颗粒。在高糖（HG）条件下以及在DKD小鼠模型中，系统评估了这些颗粒对GSDMD介导的焦亡、自噬流和能量代谢的影响。通过Western blotting、免疫染色、MitoSOX、JC-1和ATP测定法评估了线粒体功能。通过转录组分析及药理学干预，阐明了AMPK/mTOR信号轴的参与作用。

结果

CD44-Cs@Rg1纳米颗粒被肾小管上皮细胞有效内化，显著减少了焦亡，同时通过激活AMPK和抑制mTOR恢复了自噬流。这些效应改善了线粒体膜电位，减少了活性氧的积累，并增强了ATP的产生。体内实验表明，CD44-Cs@Rg1治疗显著改善了DKD小鼠的肾功能和组织病理损伤。转录组和蛋白质水平分析一致显示与AMPK信号、自噬和能量代谢相关的通路得到了富集。

结论

以CD44为靶点的壳聚糖纳米颗粒能够将人参皂苷Rg1精确递送到DKD的肾小管细胞中，通过AMPK/mTOR轴恢复线粒体稳态并调节自噬-焦亡平衡。这一纳米治疗平台显示出在DKD治疗中的强大转化潜力。

引言

糖尿病肾病（DKD）是糖尿病最常见的严重微血管并发症之一，也是终末期肾病（ESRD）的主要原因[1]，[2]。尽管DKD传统上被认为是一种肾小球疾病，但越来越多的证据表明，肾小管损伤，尤其是肾小管上皮细胞（RTECs）的功能障碍，在疾病早期就发生了，并在疾病进展中起着关键作用[3]，[4]，[5]。在高糖（HG）条件下，RTECs暴露于持续的代谢和氧化应激中，导致营养重吸收和水分-电解质稳态逐渐受损。这种功能障碍随后引发炎症反应、细胞凋亡和肾小管间质纤维化[3]，[6]。然而，直接针对RTECs代谢失调的治疗策略仍然有限。

自噬是一种关键的细胞质量控制机制，可维持线粒体完整性和代谢稳态，其功能障碍已成为DKD的早期病理事件[7]，[8]。AMP激活的蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白（AMPK/mTOR）信号轴是自噬流和细胞能量感知的中心调节器[9]。在DKD中，高糖条件下普遍观察到AMPK活性受到抑制而mTOR持续激活，这将代谢应激与自噬缺陷和线粒体损伤联系起来[10]，[11]。尽管具有治疗意义，但尚缺乏安全有效的方法来精确调节RTECs中的这一通路。

人参皂苷Rg1是人参的主要生物活性成分，已被证明具有抗氧化、抗炎和抗纤维化作用，并能调节代谢稳态。它已在心血管和脑血管疾病、肝脏疾病以及与衰老相关的疾病研究中得到广泛研究[12]，[13]。最近的研究表明，Rg1可能激活AMPK并改善线粒体功能。然而，其在DKD中的机制作用，特别是在恢复自噬流和保护RTECs免受高糖诱导的线粒体功能障碍和焦亡方面的作用仍不清楚[14]，[15]，[16]。此外，Rg1的高亲水性和快速全身清除显著限制了其在肾脏中的积累和治疗效果[17]。

壳聚糖（Cs）由于其天然来源、优异的生物相容性和可调节的表面修饰能力，已成为递送活性植物药物成分的有效载体[18]。值得注意的是，CD44在受损的肾小管中高表达，为选择性靶向病理性的RTECs提供了分子基础[19]。利用CD44介导的内吞作用可能增强治疗剂的肾脏特异性递送和细胞内摄取。

在这项研究中，我们开发了一种以CD44为靶点的壳聚糖纳米颗粒系统，其中包裹了人参皂苷Rg1（CD44-Cs@Rg1），以实现向高糖损伤的RTECs的精确递送。通过综合的体外和体内 DKD模型，我们系统研究了CD44-Cs@Rg1是否通过AMPK/mTOR轴恢复自噬流、改善线粒体功能并抑制焦亡。拯救实验进一步验证了Rg1介导的保护作用依赖于AMPK，同时全面评估了生物安全性和肾脏靶向性。这项工作揭示了Rg1介导的肾保护的新机制，并为DKD提供了一种靶向、安全且基于机制的纳米治疗策略。

部分内容摘录

化学试剂和天然产物来源

人参皂苷Rg1（纯度≥98%）购自Sigma-Aldrich（目录编号：R9879）。将其溶解在无水乙醇中制备1 mg/mL的储备溶液，并在-20°C下避光保存直至使用。壳聚糖（Cs；低分子量，脱乙酰度≥90%）购自Aladdin（目录编号：C109029）。Cs溶解在1%（v/v）醋酸水溶液中，并在60°C水浴中通过磁力搅拌完全溶解后用于实验。交联剂

成功构建了CD44-Cs@Rg1，有效包裹了Rg1，显著提高了细胞内摄取效率

为了在高糖诱导的RTEC损伤中实现Rg1的有效递送，构建了一种以Cs为骨架并修饰有CD44靶向肽的纳米颗粒系统（图1A）。CD44-Cs@Rg1纳米颗粒通过离子凝胶交联法制备。DLS分析显示平均粒径为148.6 ± 4.7 nm，Zeta电位为+21.3 ± 1.9 mV，这有利于与带负电荷的细胞膜相互作用和细胞摄取（图1B）。TEM显示

讨论

本研究系统地设计并验证了一种CD44-Cs@Rg1，能够高效装载和靶向递送人参皂苷Rg1，从而克服了DKD中生物利用度低和组织特异性不足的局限性。与之前使用游离Rg1或传统药物载体的方法[21]，[22]，[23]相比，该平台结合了CD44靶向肽，以选择性识别病理状态下CD44过度表达的肾小管上皮细胞

CRediT作者贡献声明

徐静薇：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。余如翠：撰写 – 原始草稿、项目管理、方法学、实验研究、数据管理、概念构思。吴瑞英：撰写 – 审稿与编辑、验证、软件应用、实验研究、数据管理。张燕：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、验证、资源协调、正式分析

伦理批准和参与同意

所有动物实验均获得了中国科学技术大学第一附属医院机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号：2025-N(A)-0133），并严格遵守美国国立卫生研究院（NIH）关于实验室动物护理和使用的指南。

出版同意

不适用。

数据和材料的可用性

支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

资助

本研究得到了安徽省中医药传承与创新研究项目（编号：2024ZYYXH028）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

无。