《Free Radical Biology and Medicine》：Annexin A1 enhances liver repair after acetaminophen-induced liver injury by regulating neutrophils function
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对乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肝损伤（AILI）中，肝内浸润中性粒细胞分泌的Annexin A1通过抑制中性粒细胞胞外陷阱（NETs）促进N2表型极化，加速肝再生。Ap2-26肽可逆转ANXA1缺陷小鼠的肝损伤修复缺陷。
查莉霞（Lixia Zha）| 刘登（Deng Liu）| 章梦婷（Mengting Zhan）| 徐雅茹（Yaru Xu）| 韩幽文（Youwen Han）| 何长江（Changjiang He）| 杜建（Jian Du）| 陈立坚（Lijian Chen）
安徽医科大学第一附属医院麻醉科，中国合肥230032
摘要
对乙酰氨基酚（APAP）引起的急性肝损伤（AILI）是急性肝衰竭（ALF）的主要原因，但目前有效且及时的治疗方法仍然有限。导致肝衰竭不可逆进展的机制尚未完全明了。 Annexin A1（ANXA1）是一种抗炎因子，与多种炎症性疾病有关，但其在APAP诱导的肝损伤中的作用尚不清楚。在本研究中，我们建立了一种与临床相关的APAP诱导的AILI小鼠模型，并发现肝脏中ANXA1的表达增加，主要来源于浸润的中性粒细胞。ANXA1的缺乏加剧了肝损伤并阻碍了组织修复，部分原因是由于中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成以及中性粒细胞表型的改变。通过DNase I抑制NETs可以恢复肝修复，并使ANXA1缺乏小鼠中的中性粒细胞向N2抗炎表型转变。此外，使用ANXA1衍生的肽Ac2-26进行治疗可以抑制NETs的形成并调节中性粒细胞表型，从而减轻肝损伤。这些发现表明，ANXA1通过抑制NETs来重新编程中性粒细胞，从而促进APAP诱导的肝损伤后的修复，为改善药物引起的肝损伤提供了有希望的治疗靶点。
引言
对乙酰氨基酚（APAP）是一种广泛使用的解热镇痛剂，在治疗剂量下被认为安全有效。然而，过量服用对乙酰氨基酚可引发APAP诱导的急性肝损伤（AILI），可能发展为急性肝衰竭（ALF）甚至死亡。全球范围内，APAP诱导的急性肝损伤是急性肝衰竭的主要原因[1]。以往的研究主要集中在APAP诱导的肝毒性的机制上。然而，大多数AILI患者的临床干预通常发生在损伤发生后，此时肝损伤已经超过了可逆的阈值[2]。肝脏强大的再生能力成为晚期AILI患者预后的关键决定因素[3]。因此，旨在增强APAP毒性后肝修复和再生的策略被认为可以为严重急性肝损伤患者提供更有效的治疗方法。
大量证据表明，先天性和适应性免疫细胞——包括巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞——在对乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肝损伤（ALI）中起着关键作用[4]。活化的中性粒细胞倾向于迁移到损伤部位，并通过形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs）参与炎症反应[5]。NETs是由染色质和颗粒蛋白组成的细胞外结构，包括组蛋白、髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶和DNA纤维[6]。根据Huang H等人和Yazdani HO等人的研究，NETs在肝缺血-再灌注过程中会加重肝损伤[7, 8]。NETs的形成促进了APAP诱导的ALF的进展[9]，可能是由于NETs激活了AIM2并进一步驱动了PANoptosome的组装[5]。Wang等人（2021年）报告称，在接受组织型纤溶酶原激活剂（tPA）溶栓治疗的急性缺血性中风患者中，NETs会通过激活cGAS而加重血脑屏障（BBB）的破坏并促进脑血管并发症[10]。Zheng等人（2022年）指出，NETs在糖尿病肾病中会导致肾小球内皮细胞功能障碍和凋亡[11]。在本研究中，我们观察到AILI中的中性粒细胞过度激活和NETs的形成。然而，调控NETs的关键因素以及NETs是否调节肝损伤修复尚不清楚。
中性粒细胞的过度激活不仅释放ROS和NETs，还上调N1中性粒细胞相关基因的表达，包括一氧化氮合酶（NOS2）和细胞间粘附分子1（ICAM1），同时上调替代激活相关基因如精氨酸酶-1（Arg-1）和几丁质酶样3（YM1）。有趣的是，中性粒细胞具有一定的可塑性，并会根据特定的微环境极化为N1/N2表型[12, 13]。这些变化是否发生在急性肝损伤（AILI）中的中性粒细胞过度激活时？研究表明，NETs可以促进巨噬细胞极化为M1表型[14]。鉴于中性粒细胞与巨噬细胞类似的可塑性，我们推测NETs可以调节中性粒细胞的极化。然而，NETs形成和N2表型极化在APAP诱导的急性肝损伤中的具体作用仍不明确，需要进一步研究。
ANXA1是最早被发现的annexin超家族成员，是一种37 KDa的钙依赖性磷脂结合蛋白，主要在中性粒细胞中表达[15]。ANXA1具有多种细胞保护作用，包括抗炎、抗凋亡和组织修复活性[16]。先前的研究积累的证据表明，ANXA1在多种病理条件下（如心肌梗死、中风、糖尿病肾病和非酒精性脂肪肝病）中具有保护器官功能的作用[17]。这些发现突显了ANXA1在急性器官损伤修复中的治疗潜力。然而，ANXA1在APAP诱导的急性肝损伤中的具体作用和治疗价值仍不清楚。
我们发现，在AILI的小鼠模型中，肝脏中的ANXA1蛋白水平显著升高，其中浸润肝脏的中性粒细胞是ANXA1上调的主要来源。中性粒细胞特异性的ANXA1缺乏加剧了APAP诱导的肝损伤并阻碍了损伤后的肝修复，而给予ANXA1模拟肽Ac2-26可以恢复APAP损伤的WT小鼠的肝修复功能。机制上，ANXA1通过抑制过度的NETs形成来促进肝修复，从而在肝修复的早期阶段促进中性粒细胞向修复性N2表型的转变。总体而言，我们的发现表明ANXA1是APAP肝毒性后炎症消退和肝修复的关键调节因子，这提示基于ANXA1的治疗策略可能对晚期出现的AILI患者（无论是否发展为急性肝衰竭）具有治疗前景。
所有动物实验均遵循安徽医科大学实验动物伦理委员会批准的指南（伦理批准编号：LLSC20220180），严格遵守旨在最小化动物痛苦的实验方案。实验动物中心的无特定病原体（SPF）设施中饲养了6周大的雄性C57BL/6小鼠（体重：18-20克）。
为了阐明ANXA1在AILI中的作用，我们给小鼠腹腔注射了一次APAP（400 mg/kg），随后评估了肝脏中ANXA1蛋白水平的动态变化。ANXA1水平在12小时时显著升高，24小时达到峰值，然后在48小时和72小时逐渐下降（图1）。肝脏组织的H&E染色显示，肝损伤在0小时、12小时和24小时逐渐加重。肝脏组织中的ANXA1免疫荧光染色进一步证实了这一趋势。
越来越多的证据表明，ANXA1调节免疫细胞的功能性免疫[16, 29]。在这里，我们发现了中性粒细胞衍生的ANXA1通过促进中性粒细胞的N2极化来促进急性肝损伤修复的关键作用。
APAP诱导的肝损伤是急性肝衰竭的主要原因[30, 31]。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是唯一批准用于药物诱导的肝损伤的解毒剂，在过量服用的最初几小时内给药时表现出最佳治疗效果[32, 33]。
何长江（Changjiang He）： 数据管理。
韩幽文（Youwen Han）： 数据管理。
徐雅茹（Yaru Xu）： 项目管理、数据管理。
查莉霞（Lixia Zha）： 原始草稿撰写、可视化、验证、项目管理、方法学、研究、数据分析、概念化。
章梦婷（Mengting Zhan）： 数据分析、数据管理。
刘登（Deng Liu）： 数据分析、数据管理。
陈立坚（Lijian Chen）： 监督、资源获取、概念化。
杜建（Jian Du）： 监督、资源获取、资金获取。
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。
本工作得到了国家自然科学基金（编号：82570740；82270644；82472313；82272360）的支持。
