《International Immunopharmacology》：Lysionotin nanoparticles ameliorate ethanol-elicited liver damage by inhibiting hepatocyte ferroptosis and modulating the gut-liver axis
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本研究采用微行星球磨法制备了Lysionotin纳米颗粒（Lys-NPs），显著提高了其口服生物利用度。实验证明，Lys-NPs能有效抑制乙醇诱导的肝损伤，机制涉及减少铁积累、抑制氧化应激、上调GPX4和下调ACSL4表达，同时调节肠肝轴相关炎症反应。
Fang-Fang Guo|Shuo Wang|Yan-Chao Du|Jing-Hui Chen|Tao Zeng|Hong-Lei Zhou
山东大学齐鲁医学院药学院，济南，山东250012，中国
摘要
酒精相关性肝病（ALD）是一个全球性的健康问题，其发病率正在上升，同时治疗手段也相对匮乏。Lysionotin是一种具有低口服生物利用度的多功能黄酮类化合物，具有对抗乙醇引起的肝损伤的潜力，但其具体作用机制尚未得到充分研究。在本研究中，我们采用微行星球磨技术制备了Lysionotin纳米颗粒（Lys-NPs），以提高其口服生物利用度，并通过小鼠模型评估了其对ALD的保护作用。Lys-NPs的平均粒径为329.7 ± 6.7 nm，与原始Lysionotin相比，表现出更好的稳定性、更高的溶解度以及更强的口服生物利用度。血清氨基转移酶活性的检测和组织病理学变化表明，Lys-NPs在预防乙醇引起的肝损伤方面比原始化合物更有效。机制研究表明，Lys-NPs能够抑制乙醇诱导的肝脏中铁积累、氧化应激、GPX4下调以及ACSL4上调，从而可能减轻乙醇诱导的肝细胞铁死亡（ferroptosis）。此外，Lys-NPs还能调节血清脂多糖（LPS）水平，抑制乙醇诱导的NF-κB磷酸化和NLRP3炎性小体激活。综上所述，Lys-NPs可能通过抑制乙醇诱导的铁死亡和调节肠道-肝脏轴来缓解ALD。
引言
酒精相关性肝病（ALD）是一个全球性的健康挑战，其特征是发病率高且可用的治疗方法有限。尽管对ALD发病机制的理解取得了显著进展，但目前尚无经过FDA批准的有效预防或治疗药物[1]。虽然戒酒是管理ALD的最有效策略，但在某些患者中，它可能无法阻止脂肪性肝病进展到晚期[2]。因此，迫切需要开发新型、有效且安全的ALD治疗药物。先前的研究表明，氧化应激相关的铁死亡和巨噬细胞介导的炎症在ALD的发展中起着关键作用[3][4][5]。乙醇暴露会导致肝脏中铁负荷增加，从而引发肝细胞铁死亡，这可以通过铁螯合剂和铁死亡抑制剂来特异性抑制[6][7][8][9]。此外，乙醇摄入会破坏肠道微生物群平衡，促使肠道来源的脂多糖（LPS）转移到肝脏，进而激活库普弗细胞并释放炎症细胞因子，从而通过肠道-肝脏轴引发炎症[10][11][12]。具有抗氧化和抗炎特性的天然或合成化合物可能对ALD具有保护作用。
黄酮类化合物是一大类天然化合物，具有多种酚类结构，广泛存在于各种食物中。自rutin被发现以来，已鉴定出超过8000种黄酮类化合物[13]。近几十年来，许多黄酮类化合物、富含黄酮的天然产物提取物及草药粗提物显示出对抗ALD的良好治疗潜力。例如，可可提取物和Elephantopus scaber提取物都含有丰富的黄酮类成分，能够显著减轻乙醇对小鼠的肝毒性[14][15]。某些特定黄酮类化合物（如芹菜素、吴茱萸素、黄芩素和木犀草素）也表现出对抗ALD的保护作用[16][17][18][19][20][21][22][23][24][25]。然而，由于它们的口服生物利用度较低（这归因于水溶性差、肠道渗透性有限以及肠道和肝脏中UDP-葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）的快速葡萄糖醛酸化作用[26]），其临床应用受到严重限制。许多动物实验使用的是钠羧甲基纤维素（CMC）溶液或生理盐水中的黄酮类悬浮液，未能充分解决这些生物利用度问题[20][27][28][29][30][31]。因此，在临床前试验中通常需要高剂量才能达到有效的血液浓度。值得注意的是，几乎所有用于评估ALD的黄酮类化合物的口服吸收都非常有限[32][33][34][35][36][37][38]。
Lysionotin（CAS：10176–66-6，C18H16O7），也称为Nevadensin，主要存在于Lysionotus pauciflorus中。它具有多种生物活性，包括降压、抗菌、抗氧化和抗炎作用[39]。Lysionotin不溶于水，仅微溶于甲醇、乙醇和乙酸乙酯。先前的研究证实其在大鼠体内的口服生物利用度极低[40]。Lysionotin的医学应用可以追溯到20世纪70年代，当时贵州省的一家中药厂通过水提取、过滤、沉淀和浓缩方法生产了Lysionotin片剂，用于治疗慢性气管炎。最近的研究表明，Lysionotin对金黄色葡萄球菌感染具有治疗作用[39]、镇痛效果[41]、抗肿瘤作用[42][43][44][45]以及抗过敏特性[46]。然而，目前尚未有研究探讨其低生物利用度问题，也不清楚Lysionotin是否能够缓解乙醇引起的肝损伤。
在本研究中，我们制备了Lysionotin纳米颗粒（Lys-NPs），并研究了其对ALD的保护作用及其作用机制。Lys-NPs采用自上而下的方法（研磨介质法）合成并进行了表征。大鼠药代动力学研究表明，Lys-NPs的口服生物利用度显著高于原始Lysionotin。此外，与原始Lysionotin相比，Lys-NPs在保护小鼠免受乙醇诱导的肝损伤方面表现出更强的效果。机制研究表明，Lys-NPs能够抑制乙醇诱导的氧化应激、铁积累、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）下调以及酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）上调，从而可能减轻乙醇诱导的肝细胞铁死亡。此外，Lys-NPs还能调节血清脂多糖（LPS）水平，抑制核因子κB（NF-κB）磷酸化，并减弱Nod样受体家族pyrin结构域包含3（NLRP3）炎性小体的激活。这些结果表明，Lys-NPs可能通过抑制肝细胞铁死亡和调节肠道-肝脏轴来缓解乙醇引起的肝损伤。
试剂和检测试剂盒
Lysionotin购自Biopurify Phytochemicals Ltd.（中国成都）。Liber-DeCarlio液体饮食由Dyets（美国）提供。TRIzol?试剂购自Thermo Fisher Scientific（中国北京），RT试剂盒由Takara Biomedical Technology（中国北京）有限公司提供。其他所有试剂和抗体详见补充表1。
Lys-NPs的制备与优化
Lys-NPs采用行星球磨技术制备。简而言之，将适量的原始Lysionotin悬浮在
Lys-NPs的表征
Lys-NPs呈现为橙黄色液体分散体，流动性良好，质地均匀（补充图2），在4°C下储存14天后未观察到沉淀或聚集现象。粒径分布范围为200至500 nm（平均值：329.7 ± 6.7 nm），PDI为0.405 ± 0.029（图1A）。在模拟胃液和肠液中孵育后，Lys-NPs的粒径分别增加至517.6 ± 61.7 nm和552.7 ± 107.3 nm（图1B）。SEM图像显示...
讨论
黄酮类化合物具有多种生物活性，是自然界赋予人类对抗各种疾病的宝贵资源。然而，由于其较低的口服生物利用度，它们的临床应用受到限制。最近，具有低口服生物利用度的Lysionotin引起了越来越多的关注[39][55][56][57]。纳米医学在多种疾病的诊断和治疗方面具有巨大潜力，因为它具有多个明显优势。
CRediT作者贡献声明
Fang-Fang Guo：撰写初稿、进行实验、进行正式分析。Shuo Wang：进行实验。Yan-Chao Du：进行实验。Jing-Hui Chen：进行实验。Tao Zeng：撰写、审稿与编辑、争取资金、概念构思。Hong-Lei Zhou：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（81872653）的支持。
