神经元中TLR4的表达上调会激活cGAS-STING通路，从而在EAE（实验性自身免疫性脑脊髓炎）小鼠体内诱导铁死亡（ferroptosis）

《International Immunopharmacology》：Neuronal TLR4 upregulation activates the cGAS-STING pathway to induce ferroptosis in EAE mice

本研究探讨神经元TLR4通过激活cGAS-STING通路及NCOA4介导的ferritinophagy促进铁依赖性细胞死亡在EAE中的作用，验证其机制并发现Liproxstatin-1可有效缓解神经损伤。

　　

秦洪卓|杨凌飞|杜静杰|徐小萌|陈子怡|李庆生|徐玉迪|李梦瑶|李艳飞|贾彦杰

中国郑州大学第一附属医院神经科

摘要

引言

多发性硬化症（MS）中的进行性神经功能障碍主要由神经元损伤和丢失引起，但其潜在的分子机制仍不甚明了。本研究旨在探讨神经元Toll样受体4（TLR4）在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）过程中促进铁死亡（一种依赖铁的细胞死亡途径）的作用。

方法

我们利用MOG35–55诱导的EAE小鼠模型（每组10只），结合LPS刺激的SH-SY5Y单细胞和共培养系统（3个生物学重复实验），来探究TLR4信号传导与铁死亡之间的相互作用。通过生化检测、Western blotting、RT-qPCR、共免疫沉淀、免疫荧光分析和透射电子显微镜等技术全面评估了这种关联。此外，我们还利用siRNA介导的基因沉默和共免疫沉淀技术解析了其背后的信号传导级联反应。

结果

无论是体内还是体外模型都再现了典型的铁死亡特征，包括NCOA4介导的铁蛋白吞噬作用、脂质过氧化和铁过载。从机制上讲，我们推测神经元TLR4的激活可能导致线粒体DNA释放到细胞质中，从而可能激活cGAS-STING通路并引发铁代谢紊乱。观察结果表明，即使在微胶质细胞-神经元共培养的复杂炎症环境中，TLR4信号传导仍能促进铁死亡。在EAE小鼠中，通过Liproxstatin-1药理学阻断铁死亡似乎可以改善临床症状，这与大脑和脊髓中GPX4表达的恢复以及脂质过氧化的抑制有关。

讨论

本研究提出了一种特定的TLR4-mtDNA-cGAS-STING-NCOA4信号传导级联反应，该级联反应可能促进EAE小鼠的神经元铁死亡。这些发现揭示了MS中神经元损伤的新机制，并强调了针对这一内在神经元通路可能是改善进行性神经退行性的有希望的治疗策略。

引言

多发性硬化症（MS）是一种慢性中枢神经系统（CNS）炎症性疾病，是年轻人非创伤性神经功能障碍的主要原因，其主要病理特征包括炎症性脱髓鞘、胶质增生和神经元损伤。目前FDA批准的治疗方案主要侧重于调节免疫系统、保护CNS免受进一步损伤、减轻复发频率和严重程度以及延缓功能障碍的进展。然而，目前没有任何治疗方法能够治愈MS、逆转已形成的损伤或完全阻止进行性神经退行性变[1],[2]。因此，进一步探索MS过程中神经功能障碍的病理生理机制对于发现潜在的分子靶点至关重要，这些靶点可能为新型治疗药物的开发提供线索。

MS发病的一个标志是中枢神经系统（CNS）中的持续炎症浸润，这通常归因于免疫细胞和胶质细胞的激活，导致轴突损伤和脱髓鞘。在这一过程中，神经元损伤和死亡常被视为CNS炎症扩散的次要后果。然而，很少有研究关注神经元是否也主动参与MS病理的进展，而不仅仅是被动受害者。越来越多的证据表明，神经元通过分泌炎症因子、调节免疫细胞和激活炎症通路积极参与神经炎症的发展[1],[2]。在MS的EAE小鼠模型中，观察到神经元密度降低、轴突长度缩短以及神经元和突触标记物表达减少，表明存在显著的神经退行性变[3]。此外，在MS进展的晚期阶段，由于神经元丢失导致脑萎缩，神经元损伤和死亡是进行性神经退行性的关键驱动因素。然而，这种神经元损伤的精确机制仍不完全清楚。开发直接针对神经元的疗法可能规避与免疫抑制相关的风险（如调节微胶质细胞或淋巴细胞），从而直接减轻神经元的进行性损伤或丢失，进而改善MS患者的运动功能障碍。

TLR4是一种模式识别受体，在大多数类型的CNS细胞中广泛表达，负责检测内源性和外源性危险相关分子模式（DAMPs/PAMPs）和病原体相关分子模式（DAMPs/PAMPs），其异常激活可引发炎症反应和细胞死亡[4],[5]。在MS的病理过程中，持续的炎症以及髓鞘和其他受损/炎症细胞释放的降解产物和介质会激活TLR2/TLR4，导致促炎细胞因子（如IL-1β）的产生增加，这被认为与MS的发病机制有关[6],[7]。研究表明，抑制TLR4可以改善EAE小鼠的临床症状，突显了TLR4作为MS治疗靶点的潜在价值[8],[9]。此外，环状GMP-AMP合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）信号通路是先天免疫反应中的关键参与者，可被异常的双链DNA激活，从而参与宿主防御和免疫反应[10]。越来越多的证据表明，cGAS还通过检测错位的內源性DNA来监测细胞完整性。在无菌炎症中，由于细菌来源，线粒体DNA（mtDNA）已成为有效的DAMP[11]。在细胞应激条件下，mtDNA可泄漏到细胞质中并异常触发cGAS-STING级联反应[12],[13]。最近关于cGAS-STING通路的研究扩展到了CNS疾病[14],[15],[16]。TLR4和cGAS-STING通路之间可能存在复杂的信号相互作用，这在急性肺损伤和乳腺炎等疾病的病理生理进展中起着关键作用[17],[18],[19]。然而，在MS这一特定领域，TLR4和cGAS-STING通路在调节疾病进展方面的相互作用程度仍是一个未充分探索的领域，需要进一步研究以阐明它们对MS发病机制的潜在协同效应。

此外，核受体共激活因子4（NCOA4）似乎是STING的靶点。NCOA4是一种参与铁稳态的关键蛋白质，它通过与铁蛋白重链1（FTH1）结合并将其转运到自噬体中进行降解，从而释放氧化还原活性Fe²⁺。升高的Fe²⁺水平可通过Fenton反应直接促进活性氧（ROS）的生成，加剧氧化损伤并驱动铁死亡。铁死亡是一种依赖铁的细胞死亡形式，其特征是脂质过氧化，通常由铁代谢紊乱和严重的脂质过氧化触发，它与炎症有复杂的相互作用[20]。先前的研究已在MS患者中发现铁沉积[21],[22]，新的证据表明MS患者样本中存在铁死亡的特征，包括铁水平升高、脂质过氧化增加和抗氧化能力下降[23],[24]。Woo等人最近报告称，神经元中STING的激活会引发神经炎症，并与神经元中的铁死亡相关[25]。NCOA4介导的铁蛋白吞噬作用通过调节细胞铁稳态促进铁死亡[26]。先前的研究还阐明了退行性神经系统疾病与铁代谢紊乱之间的密切关联[27]。然而，NCOA4是否通过改变铁稳态来促进MS/EAE的发展仍需进一步研究。虽然这些发现表明炎症和铁死亡之间的相互作用对MS的进展有显著影响，但它们之间的相互作用机制及其对神经退行性的贡献仍不清楚，需要进一步研究。在这项研究中，我们重点关注TLR4、cGAS-STING和NCOA4之间的潜在多分子相互作用，这些相互作用可能通过复杂的信号网络和调节机制共同调控MS/EAE的进展。我们证明了神经元中TLR4和cGAS-STING激活之间存在潜在的信号相互作用，这对于调节神经元内的铁代谢尤为重要，尤其是通过NCOA4介导的铁蛋白吞噬作用。我们在微胶质细胞-神经元共培养环境中验证了这些发现，并证明药理学抑制铁死亡可以在体内有效修复神经元缺陷。这些发现为阐明MS发病机制中炎症和铁死亡以及其他信号通路之间的相互作用提供了框架。

动物和伦理声明

从河南省实验动物中心购买了8至9周大的C57BL/6小鼠，将它们（每笼5只）饲养在受控的环境条件下，包括12小时的光暗周期、23±3°C的室温以及55±5%的相对湿度。食物和水可以自由获取。为了确保动物适当适应环境，实验开始前让它们适应了一周。在此期间，

EAE小鼠大脑中的异常铁代谢介导铁死亡通路的激活

为了研究MS的病理机制，在C57BL/6小鼠中诱导了EAE模型（图1A）。EAE小鼠在免疫后第20天表现出进行性的神经功能缺陷，并显示出特征性的中枢神经系统炎症和脱髓鞘，证实了模型的成功诱导（图1B-F）。为了研究EAE小鼠运动缺陷发展的病理生理机制，我们发现其大脑中的铁含量升高

讨论

在MS的进展过程中，大脑中的广泛脱髓鞘病变与胶质细胞介导的炎症密切相关，而驱动神经功能缺陷和突触丢失的病理机制则受到较少关注。本研究阐明了EAE小鼠中的一个关键机制，即神经元损伤与TLR4上调及随后的cGAS-STING通路激活密不可分。体外实验使我们能够详细分析这一过程

CRediT作者贡献声明

秦洪卓：撰写——原始草稿、可视化、验证、正式分析、数据管理。杨凌飞：撰写——审阅与编辑、验证、方法学。杜静杰：撰写——审阅与编辑、研究。徐小萌：撰写——审阅与编辑、研究。陈子怡：撰写——审阅与编辑、方法学。李庆生：撰写——审阅与编辑。徐玉迪：撰写——审阅与编辑、软件操作。李梦瑶：撰写——审阅与编辑。李艳飞：撰写——审阅与编辑，

伦理批准和参与同意

本研究获得了郑州大学伦理委员会的批准（批准编号2023-KY-0741-003），以及河南省医学科学技术攻关项目的联合支持（LHGJ20220332，资助对象为李艳飞）。

资助

本研究得到了河南省自然科学基金（资助编号232300420037，资助对象为贾彦杰）和河南省医学科学技术攻关项目的联合支持（LHGJ20220332，资助对象为李艳飞）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

实验动物的饲养得到了河南省实验动物中心的支持。组织病理学研究得到了郑州大学医学院和郑州大学第一附属医院转化医学中心的支持。