《International Immunopharmacology》：An indoloquinolinone 3a alleviates lipopolysaccharide-induced acute lung injury by modulating the NF-κB and AMPK/Nrf2 signaling pathways
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急性肺损伤（ALI）的炎症和氧化应激机制研究显示，化合物3a通过抑制NF-κB信号通路及激活Nrf2/AMPK通路显著减轻脂多糖诱导的ALI小鼠肺损伤，降低炎症因子水平并增强抗氧化防御。
田文月|刘志燕|刘家正|孔凌凯|秦红燕|朱国元|张伟|金静|王晓健|江志红|白丽萍
澳门科技大学应用医学与健康研究所中药机理与质量国家重点实验室，中国澳门塔ipa 999078
摘要
急性肺损伤（ALI）是一种以难治性低氧血症为特征的肺部疾病，其中急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是最严重的形式。在后疫情时代，ARDS仍然与较高的发病率和死亡率相关。不受控制的炎症反应和氧化应激被认为是导致ALI的关键病理机制。本研究探讨了吲哚喹啉酮3a（一种吲哚衍生的吡非尼酮衍生物）对脂多糖（LPS）诱导的ALI的保护作用及其潜在的分子机制。体内实验表明，3a显著减轻了肺组织损伤，降低了支气管肺泡灌洗液（BALF）中的湿/干重量比和总蛋白浓度，上调了ZO-1的表达，抑制了中性粒细胞的浸润和髓过氧化物酶（MPO）的活性，降低了TNF-α和IL-6、IL-1β的水平，下调了环氧化酶-2（COX-2）的表达，并减少了PGE2的含量。体外实验中，3a通过抑制骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）和RAW 264.7细胞中的NF-κB信号通路，显著抑制了LPS刺激的炎症反应。此外，3a通过增加谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的水平，增强了ALI小鼠的抗氧化防御能力，同时降低了活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的水平。在LPS刺激的巨噬细胞中，3a还通过激活AMPK和上调Nrf2及关键抗氧化酶来阻止ROS的产生。总体而言，吲哚喹啉酮3a改善了LPS诱导的ALI，而AMPK介导的NF-κB抑制和Nrf2激活可能是其抗炎和抗氧化作用的基础。
引言
急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是具有全球高发病率和死亡率的危及生命的呼吸系统疾病[1]、[2]。ALI/ARDS的典型特征包括肺泡毛细血管屏障的破坏、弥漫性肺泡损伤和肺水肿，这通常会导致低氧性呼吸衰竭[3]。迄今为止，尚未发现有效的药物治疗方法，机械通气和支持性治疗仍是主要的临床干预措施[4]。然而，预防性机械通气策略可能会因过度扩张和反复的机械牵拉应力而加重肺损伤，从而导致 ventilator-induced lung injury（机械通气引起的肺损伤）[5]。鉴于ALI/ARDS持续的高发病率和死亡率，迫切需要开发新的有效治疗药物。
炎症和氧化应激是密切相关的过程，在ALI的发病机制中起着重要作用[6]、[7]。感染后，肺泡毛细血管屏障的完整性受到破坏，导致通透性增加，炎症细胞（如中性粒细胞和巨噬细胞）渗入肺泡空间。这种细胞浸润会触发过多的促炎细胞因子的释放，进一步放大炎症反应[8]、[9]。肺炎和败血症是ALI最常见的两种原因，其特征是包括TNF-α、IL-6和IL-1β在内的促炎细胞因子的过度产生[10]、[11]、[12]、[13]。此外，浸润到肺部的中性粒细胞和活化的巨噬细胞还会促进ROS的生成。过量的ROS会产生氧化应激，损害内皮细胞和上皮细胞，这被认为是ALI病理生理学的关键因素[6]、[14]。因此，针对炎症和/或氧化应激的抑制可能是预防和治疗ALI的有希望的治疗策略。
NF-κB、Nrf2和AMPK介导的关键信号通路通过调节炎症和氧化应激对ALI的进展至关重要。NF-κB是一种主要的炎症反应转录因子，在LPS诱导的ALI中驱动促炎细胞因子（如TNF-α、IL-6和IL-1β）以及促炎介质（包括NO和PGE2）的表达[15]、[16]。作为抗氧化防御的中心调节因子，Nrf2上调抗氧化酶和抗氧化剂的转录，以对抗过量的ROS并减轻氧化应激[17]。此外，AMPK在能量代谢、氧化应激和炎症方面具有多效性作用，在ALI的发病机制中与NF-κB和Nrf2有明显的相互作用[18]、[19]。例如，调节AMPK/NF-κB轴可以减少促炎细胞因子的产生，从而缓解LPS诱导的ALI[20]，而AMPK介导的Nrf2激活对LPS诱导的ALI具有保护作用[21]。
吡非尼酮是一种抗纤维化和抗炎药物，已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于特发性肺纤维化（IPF）[22]，在临床前和临床研究中显示出治疗ALI和ARDS的潜力[23]、[24]。然而，吡非尼酮的主要局限性在于其严重的副作用以及需要较高的剂量才能在病变器官中达到治疗效果[22]、[25]、[26]。先前的研究表明，某些基于吲哚的衍生物在ALI或ARDS模型中具有潜在的治疗效果，这突显了吲哚作为其抗炎活性的关键药效团的作用[27]、[28]、[29]。吲哚喹啉酮3a就是我们团队通过高效的一锅法合成的这种吲哚衍生的吡非尼酮[30]。因此，本研究旨在系统评估吲哚喹啉酮3a在体外和体内模型中对LPS诱导的ALI的保护作用，并阐明其潜在的分子机制。
材料与试剂
吲哚喹啉酮3a（纯度≥98%）是在我们的研究实验室合成的，其化学结构如图1A所示。LPS（来自大肠杆菌 O55:B5血清型）和3-(4, 5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物（MTT）购自Sigma-Aldrich Inc.（美国密苏里州圣路易斯）。地塞米松（DEX）购自Solarbio Technology Co., Ltd.（中国北京）。化合物C（AMPK抑制剂）和Brusatol（Nrf2抑制剂）购自MedChem Express
吲哚喹啉酮3a改善小鼠LPS诱导的急性肺损伤
建立了一个LPS诱导的ALI小鼠模型，以研究吲哚喹啉酮3a的保护作用。实验设计的示意图见图1B。通过H&E染色进行组织病理学分析，以评估吲哚喹啉酮3a对LPS诱导的ALI的影响。如图1C所示，对照组显示出正常的肺结构，肺泡空间清晰可见。相比之下，LPS组表现出严重的组织病理学变化
讨论
过度的炎症反应和不受控制的氧化应激是ALI/ARDS发病机制的核心，目前仍缺乏有效的药物治疗方法[4]、[6]、[7]。尽管吡非尼酮在ALI/ARDS方面显示出临床潜力，但其高剂量要求和副作用限制了其应用[22]、[26]。基于吲哚药效团的抗炎特性，开发基于吲哚的衍生物显得尤为重要
CRediT作者贡献声明
田文月：撰写——初稿、方法学、实验设计、数据分析。刘志燕：实验设计。刘家正：实验设计。孔凌凯：方法学。秦红燕：撰写——审稿与编辑、方法学。朱国元：软件操作、数据分析。张伟：软件操作、数据分析。金静：方法学。王晓健：方法学。江志红：撰写——审稿与编辑、资金获取。白丽萍：撰写——审稿与编辑、监督、资源协调，
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了澳门特别行政区科学技术发展基金（文件编号：0161/2024/AMJ, 0001/2023/AKP, 006/2023/SKL, 0074/2019/AMJ）和国家重点研发计划（文件编号：2024YFE0201300）的财政支持。此外，本研究还得到了广东省科学技术厅和澳门科学技术发展基金（项目编号：2025B1212040001和0002/2025/COP）的资助。
