抑制ROCK2可通过Src-Ca2+-NFATc1信号通路阻碍破骨细胞的生成，并缓解卵巢切除术引起的骨质流失

《International Immunopharmacology》：Inhibition of ROCK2 impedes osteoclastogenesis through Src-Ca2+-NFATc1 signaling pathway and alleviates ovariectomy-induced bone loss

ROCK2抑制剂KD025通过抑制NF-κB/p38-c-Fos和Src-Ca2+-NFATc1信号通路减少破骨细胞分化及骨吸收，预防骨质疏松小鼠骨丢失，并在患者巨噬细胞中有效，提示ROCK2为骨质疏松治疗新靶点。

　　

秦阳|陈建超|李丽红|陈子业|李若鹏|郑杰煌|陈艳|王松|李晓娟

中国广东省广州市510515，南方医科大学药学院，国家药品监督管理局炎症与免疫疾病药物研究创新项目抗炎与免疫调节药理学实验室，药物代谢研究与评价重点实验室，广东省新药筛选重点实验室

摘要

骨质疏松症是一种代谢性骨病，严重骨质疏松引起的骨折可能导致永久性残疾。针对过度激活的破骨细胞已成为治疗骨质疏松的策略之一。选择性口服Rho相关卷曲螺旋激酶2（ROCK2）抑制剂KD025最近已被FDA批准用于治疗慢性移植物抗宿主病（cGVHD）。KD025通过抑制促炎细胞因子的分泌，在体内能够治疗胶原诱导的关节炎，而ROCK2在骨质疏松中的作用和机制仍有待确定。在本研究中，我们发现OVX诱导的骨质疏松小鼠模型中前破骨细胞中的ROCK2表达显著上调。KD025通过其选择性抑制剂在体内阻止了OVX诱导的骨丢失。机制上，KD025对ROCK2的抑制作用通过下调NF-κB/p38-c-Fos信号通路、Src-Ca²⁺-NFATc1通路以及Trap、Oscar等破骨细胞相关基因的表达，抑制了骨髓来源巨噬细胞（BMMs）中的破骨细胞生成、骨吸收和F-actin环的形成。同时，KD025对体外破骨细胞分化没有显著影响。此外，在沉默ROCK2后，KD025对破骨细胞生成和NFATc1-luc转录的抑制作用减弱。在翻译研究中，KD025显著抑制了来自骨质疏松患者的CD14⁺巨噬细胞中的病理破骨细胞生成和骨吸收功能。总体而言，我们的发现表明ROCK2是破骨细胞介导的骨溶解的一个有前景的目标，并突显了KD025作为骨质疏松和转移性骨破坏治疗药物的潜力。

引言

骨质疏松症的特点是骨量异常减少和骨质量下降，尤其在绝经后雌激素缺乏的女性中更为常见[1]、[2]。骨质疏松的发病机制涉及骨重塑失衡，即破骨细胞介导的骨吸收超过了成骨细胞介导的骨形成[3]。过度激活的破骨细胞导致的骨丢失可引发骨质疏松及其并发症，包括骨折风险增加和骨再生能力受损[4]。因此，针对破骨细胞分化或功能的抗骨质疏松药物已在临床实践中出现。作为代表性的通过靶向抑制破骨细胞的抗骨质疏松药物，双膦酸盐和denosumab（一种针对RANKL的单克隆抗体）可能会导致非典型股骨骨折和颌骨坏死，从而造成残疾[1]、[5]、[6]。因此，仍需进一步探索具有更好风险效益比的、安全有效的针对破骨细胞的骨质疏松治疗药物。 破骨细胞是专门用于骨吸收的大型多核髓系细胞[7]。据报道，破骨细胞的过度激活在许多疾病（如骨质疏松、类风湿性关节炎和骨转移性癌症）的发病机制中起着关键作用[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。破骨细胞的骨吸收活性依赖于其复杂的细胞骨架，包括肌动蛋白、微管和其他细胞骨架蛋白。破骨细胞细胞骨架已被证实是抑制病理骨吸收的治疗靶点[14]。经典机制中，RANKL与其受体RANK结合后激活多种信号通路，包括核因子-κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、激活蛋白（AP-1）、Ca²⁺信号通路和核因子活化T细胞胞质1（NFATc1）信号通路，最终通过诱导破骨细胞特异性基因表达来启动破骨细胞形成，从而促进骨吸收[15]、[16]、[17]、[18]。 Rho相关蛋白激酶（ROCK），包括ROCK1和ROCK2，是小GTP酶RhoA的最佳表征的效应物之一。尽管这两种ROCK异构体有许多相似之处，但它们也具有独特的功能。例如，ROCK1和ROCK2在调节肌动蛋白细胞骨架组织、内皮功能障碍、脑缺血损伤和神经退行性变化方面有不同的作用[19]、[20]、[21]。ROCK2参与多种疾病的发展，如肺纤维化、系统性红斑狼疮、cGVHD和癌症[22]、[23]、[24]、[25]。值得注意的是，口服选择性ROCK2抑制剂KD025（Belumosudil）于2021年7月16日被FDA批准用于治疗cGVHD[26]。此外，还进行了多项临床试验来开发KD025的其他适应症，如系统性硬化症、寻常型银屑病和特发性肺纤维化，二期临床试验结果显示有效（ClinicalTrials.gov 标识符： NCT03919799、 NCT02317627、 NCT02688647）。此外，KD025通过减少促炎细胞因子的分泌，在体内能够治疗胶原诱导的关节炎[27]。最近，还有一些针对ROCK2设计的抑制剂用于治疗痛风性关节炎和银屑病，在体内具有良好的药代动力学特性和安全性[28]、[29]。此外，ROCK2可以稳定肌动蛋白细胞骨架，调节MAPK、NF-κB、PI3K/AKT、NFATc1等多种与破骨细胞生成相关的信号通路[19]、[30]、[31]、[32]，并且RhoA与Rock2相互作用参与破骨细胞的形成[32]。然而，ROCK2是否可以直接作为破骨细胞抑制剂的靶点来治疗骨质疏松等骨破坏疾病尚不清楚。 在本研究中，我们观察到OVX小鼠前破骨细胞中ROCK2基因表达上调。KD025在体外显著抑制了破骨细胞生成，而不影响成骨细胞分化，并在体内防止了雌激素缺乏引起的骨丢失。KD025还显著抑制了来自骨质疏松患者的CD14⁺巨噬细胞中的破骨细胞生成。我们的发现表明ROCK2是与破骨细胞相关疾病的宝贵靶点，其特异性抑制剂KD025可作为治疗骨质疏松的破骨细胞抑制剂。

试剂

选择性ROCK2抑制剂KD025（#T6867）购自TargetMol公司。NF-κB和NFATc1-Luc转染的RAW264.7细胞由澳大利亚西澳大学Jiake Xu教授提供[33]、[34]。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（#C11995）、α-MEM（#41061029）、α-MEM（酚红）（#C12571500BT）、青霉素和链霉素（#15140–122）以及澳大利亚胎牛血清（FBS）购自Gibco（美国马里兰州Rockville）。

OVX诱导的骨质疏松中BMMs中的ROCK2基因表达显著上调，选择性口服ROCK2抑制剂KD025在体内改善了骨丢失

首先，我们观察到OVX诱导的骨质疏松小鼠BMMs中ROCK2基因表达显著增加（图1A），表明ROCK2可能参与该疾病。KD025是一种选择性ROCK2抑制剂（图1B），最近已被批准用于临床治疗cGVHD[35]。然后我们使用KD025评估了其在体内对OVX诱导的骨质疏松的影响，结果如图1C所示。血清中的CTX-1是一种与骨吸收相关的生物标志物。

讨论

骨质疏松是一种由于破骨细胞过度激活引起的广泛存在的骨病。因此，寻找新的靶点以抑制破骨细胞对于开发治疗骨质疏松的药物具有价值。我们的数据表明ROCK2是破骨细胞分化的靶点，选择性抑制ROCK2可以抑制破骨细胞生成并防止雌激素缺乏引起的骨质疏松。 目前，我们首次观察到OVX小鼠前破骨细胞BMMs中ROCK2基因表达显著上调。

结论

总之，本研究确定ROCK2是治疗骨破坏的宝贵靶点。通过靶向抑制ROCK2，可以通过NF-κB/p38-c-Fos和Src-Ca²⁺-NFATc1通路抑制OVX诱导的骨丢失。ROCK2的抑制还可以抑制骨质疏松患者的病理破骨细胞生成。因此，用于临床治疗cGVHD的选择性口服ROCK2抑制剂KD025可以作为破骨细胞抑制剂。 秦阳：撰写——原始草稿、可视化、验证、项目管理、方法学、研究、数据分析、概念化。 陈建超：研究、方法学、可视化。 李丽红：研究。 陈子业：研究。 李若鹏：研究。 郑杰煌：研究。 陈艳：研究。 王松：撰写——审稿与编辑、监督、资源协调。 李晓娟：撰写——审稿与编辑、监督、资源协调、资金支持。

伦理批准

所有动物实验方案均获得了南方医科大学机构动物护理和使用委员会的批准（编号L2019205）。骨质疏松患者来自南方医科大学南方医院，伦理批准获得了南方医院伦理委员会的批准（编号NFEC-202101-K14–01，伦理批准日期：2021年1月22日）。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（82173825, 81773740）对X.L.的支持。