《International Journal of Mass Spectrometry》：Morphology Assessment Enabled by Room-Temperature Soft-Landing in Native MS
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室温离子软 landing 技术结合负染色TEM成功制备了TRAP和VFLIP等蛋白质复合物样本，验证了其稳定性和可重复性。通过优化设备设计，在保留HCD细胞功能的同时实现离子软 landing，为结构生物学早期研究提供高效、低成本的解决方案。
齐子豪（Zihao Qi）| 林宇福（Yu-Fu Lin）| 索菲·R·哈维（Sophie R. Harvey）| 乔舒亚·D·吉尔伯特（Joshua D. Gilbert）| 贾里德·B·肖（Jared B. Shaw）| 奥斯汀·Z·萨洛梅（Austin Z. Salome）| 杜晨（Chen Du）| 马里乌斯·M·科斯特利奇（Marius M. Kostelic）| 莱斯塔·M·赖（Stella M. Lai）| 安德鲁·J·阿斯兰尼安（Andrew J. Arslanian）| 乔舒亚·J·库恩（Joshua J. Coon）| 维基·H·维索茨基（Vicki H. Wysocki）
美国俄亥俄州哥伦布市俄亥俄州立大学化学与生物化学系，Native MS Guided Structural Biology Center，邮编43210
摘要
质谱法（nMS）能够保留非共价相互作用，从而在气相中保持蛋白质复合物的天然状态。本文评估了将nMS与室温离子软着陆技术结合使用，作为用于单颗粒蛋白质电子显微镜成像的制备技术。首先，我们使用库恩（Coon）开发的室温离子软着陆装置，对两种选定的蛋白质复合物——trp RNA结合衰减蛋白（TRAP）和改良的SARS-CoV-2蛋白（VFLIP）进行了实验。对着陆颗粒的低分辨率负染色TEM图像与已发表的这两种蛋白质复合物结构基本一致。随后，我们在俄亥俄州立大学（OSU）复制了库恩的离子软着陆装置，并对其进行了改进，以保留HCD细胞。这种配置最大限度地减少了标准仪器操作的干扰，无论是否使用电子捕获表面诱导解离（ExD-SID）细胞，都能使HCD MS/MS分析或ExD/SID产生的片段在进入Orbitrap进行质量分析前在HCD细胞内发生碰撞冷却。总体而言，我们的结果证实并扩展了室温离子软着陆技术的应用。借助这些多维信息，包括生物分子复合物的质量数据和粗略的形状信息，我们认为该方法有助于结构生物学研究早期的样品制备和评估。值得注意的是，改进后的软着陆装置已在配备ExD-SID的UHMR仪器上使用长达9个月（ExD-SID位于选择四极杆和C-trap之间），在此期间其他研究成员仍能正常进行常规的nMS实验，并获得了与未安装软着陆装置的仪器相当的结果。这一装置将有助于未来对蛋白质复合物的电荷还原前体及其碎片离子进行软着陆、ExD处理、HCD冷却和SID分析。
引言
离子软着陆技术最初由库克斯（Cooks）及其同事开发，用于表面修饰和质谱制备。(1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9) 该技术涉及将离子温和地沉积在质谱仪内部或常温条件下。(10), (11), (12), (13) 后来，这项技术被应用于生物样品，发现通过电喷雾离子化（ESI）产生的软着陆生物分子在沉积后仍能保持其天然活性。(14) 在此基础上，罗宾逊（Robinson）及其同事率先将软着陆质谱技术用于结构生物学研究。(15), (16) 质量选定的大分子复合物可以通过四极杆等质量分析器直接沉积到TEM网格上，从而提高TEM样品的均匀性并加快后续图像处理速度。(15), (17) 最近的发展将该技术推进到低温条件，避免了蛋白质复合物的定向问题，实现了更高分辨率的天然结构分析。(18), (19), (20) 尽管由于缺乏溶剂和冰嵌入导致某些复合物的局部分辨率略有下降，但研究表明激光诱导的再水化可以恢复其天然结构。(21), (22) 最近这一技术还被应用于膜蛋白复合物的研究。(23)虽然低温软着陆技术具有显著的结构优势，但需要复杂的仪器改造。相比之下，室温软着陆技术对仪器的改造要求较低，且与低分辨率负染色TEM或直接将室温软着陆后的颗粒快速冷冻至液氮中再进行冷冻电镜（cryo-EM）测量相结合时，也能获得有希望的拓扑结构结果。(15), (16), (24), (25)
在这项研究中，我们有两个目标：首先通过在其仪器上验证库恩研究小组开发的室温软着陆技术的稳健性和重复性；随后在俄亥俄州立大学的商用Q Exactive UHMR上复制该技术。(24) 我们使用之前发表的着陆配置验证了室温软着陆技术的有效性，以一个较小的（约100 kDa）环状蛋白质复合物TRAP和一个特定的SARS-CoV-2刺突蛋白变体作为示例。(29), (30) 其次，我们对俄亥俄州立大学的商用UHMR仪器进行了简单改造，目的是展示1) 研究人员可以使用该装置进行天然质谱分析以评估样品完整性(31)，同时保持HCD细胞的完整性；2) 利用软着陆技术评估目标生物分子的粗略形状。对我们来说，保持HCD细胞的完整性尤为重要，因为我们在C-trap之前的离子引导多极杆位置安装了ExD-SID装置。(32) 当大分子复合物在该装置中经过电荷还原和/或活化后，产物会被送入HCD细胞进行碰撞冷却和/或碎片化，然后再返回C-trap并注入Orbitrap。概念验证结果表明，在所有测试条件下，都能清晰地观察到GroEL（由两个7聚体环组成的结构）的顶视图和侧视图。
总体而言，这些初步结果证明了室温离子软着陆技术在结构生物学中的实用性和经济性。虽然低温软着陆、低温转移和冷冻电镜能够提供更高的分辨率，但简单的室温实验结合低分辨率负染色TEM分析，在需要整体评估样品形状（例如环状与螺旋状）或在没有冷冻设备的环境中仍具有价值。
材料与样品制备
醋酸铵（AmAc）、伴侣蛋白GroEL和聚丙二醇（PPG）购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州）。GroEL突变体D398A由德克萨斯A&M大学（College Station，德克萨斯州）的Rye实验室表达和纯化。VFLIP（V Flexibly Linked, Inter-Protomer spike）由加州大学圣地亚哥分校的Saphire实验室表达和纯化。Bacillus stearothermophilus中的TRAP由俄亥俄州立大学的Foster实验室表达和纯化。基质着陆的蛋白质复合物展现出预期的天然结构
最初的着陆实验是在俄亥俄州立大学研究人员访问华盛顿大学（UW）期间进行的，采用聚丙二醇（PPG）基质进行样品沉积，随后进行典型的负染色TEM分析。UW的实验系统提供了有希望的基准结果，(17), (24), (25) 因此我们希望在进一步改进之前，在另一个实验室（Wysocki，俄亥俄州立大学）复制该实验配置。结论
本研究扩展了库恩实验室开发的基质着陆技术的应用范围：1) 一种质量（91 kDa）和体积都较小的环状蛋白质复合物TRAP，其内部空腔相对于环直径较大；2) 一种具有非环状结构的特定共价设计刺突蛋白VFLIP Delta变体。在这两种情况下，实验结果都与预期尺寸相符。此外，我们还设计了一种简单的室温基质着陆装置。
作者贡献声明
马里乌斯·M·科斯特利奇（Marius M. Kostelic）： 方法学、实验设计。杜晨（Chen Du）： 方法学、实验设计。奥斯汀·Z·萨洛梅（Austin Z. Salome）： 文稿撰写——审稿与编辑、方法学、实验设计、概念构思。贾里德·B·肖（Jared B. Shaw）： 文稿撰写——审稿与编辑、方法学、实验设计、概念构思。乔舒亚·D·吉尔伯特（Joshua D. Gilbert）： 文稿撰写——审稿与编辑、方法学、实验设计、概念构思。索菲·R·哈维（Sophie R. Harvey）： 文稿撰写——审稿与编辑、方法学、实验设计、概念构思。齐子豪（Zihao Qi）： 文稿撰写——审稿与编辑利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。致谢
作者感谢加州大学圣地亚哥分校的Erica Ollmann Saphire实验室提供VFLIP；德克萨斯A&M大学的Hays Rye实验室提供GroEL突变体D398A；俄亥俄州立大学的Mark P. Foster和William J. Moeller提供TRAP。同时感谢俄亥俄州立大学校园显微镜与成像设施（CMIF）和综合癌症中心（OSUCCC）显微镜共享资源（MSR）的支持。该设施部分资金来源于美国国家癌症研究所的P30 CA016058资助。
