《Chemical & Biomedical Imaging》：Fast, Streamlined In Situ Genotyping of Bacterial Strains for Single-Cell and Subcellular Dynamics Profiling
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这项研究针对细菌菌株高通量动态表型筛选中的核心瓶颈，提出了一套集成的、生理兼容性强的解决方案。通过在微流控芯片中进行表面修饰（PDMS-BCP处理），有效抑制了荧光探针非特异性聚集，将原位基因分型时间缩短至一夜内完成；同时利用拷贝数可调质粒（pTrig）实现了表型记录与基因分型信号放大在时间上的解耦，从而在单细胞及亚细胞尺度上，实现了对质粒拷贝数敏感的动态过程（如MinCDE系统振荡）的高通量、低扰动筛选。这一流程显著提升了图像筛选技术的效率与适用性，为系统与合成生物学研究开辟了新路径。
引言
生物学中的时间动态，例如细胞周期振荡、转录爆发以及相分离凝聚物的受控组装与解聚，构成了重要的调控层面。然而，现有技术，包括DNA测序、酶标仪和荧光显微镜，在时间分辨率、单细胞与亚细胞信息获取以及实验通量之间存在根本性的权衡。这种权衡不仅割裂了我们对基本细胞过程的理解，也阻碍了对动态表型的大规模筛选。为应对这些局限性的努力已开始出现。一种有前景的方法将微流控芯片中细菌混合库的活细胞延时成像与顺序荧光原位杂交（sequential fluorescence in situhybridization, seqFISH）相结合，从而将单个细胞展示的动态表型与其对应基因型联系起来。然而，该策略的广泛应用受到两个技术挑战的限制：(1) 在狭窄的微流控生长室中，非特异性荧光探针聚集损害了原位基因分型效率；(2) 依赖于高拷贝数质粒来确保基因分型灵敏度，这常常会扭曲动态表型，并在活细胞成像期间干扰正常生理功能。
本研究针对这两项限制，提供了一套集成且生理兼容的解决方案。我们引入了一种简单的表面修饰策略来抑制微流控芯片中的荧光探针聚集，使得稳健的原位基因分型能够在一夜内完成。同时，我们采用条形码化的拷贝数可调质粒，以解耦活细胞成像与事后基因分型的矛盾要求，从而在保持基因分型灵敏度的同时，保护了精细的亚细胞动力学。这些改进共同将基于图像的细菌筛选转变为更快速、扰动更小的工作流程，拓展了高通量单细胞及亚细胞动力学筛选在基础与合成生物学研究中的可扩展性和通用性。
结果与讨论
微流控芯片表面修饰改善原位基因分型的信噪比
我们推测，通过增加真实信号幅度或抑制每个seqFISH循环中的背景荧光，可以缩短原位基因分型所需时间。因此，本研究首先着手解决先前报道的、由探针在母机芯片上非特异性吸附引起的背景问题，旨在同时提高信噪比并加速原位基因分型。定量评估显示，在未经处理的聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane), PDMS）芯片中，荧光探针（特别是ATTO 550和Alexa Fluor 647）在生长陷阱中表现出强烈的非特异性滞留。
荧光染料与微流体表面之间的相互作用受疏水吸附和特定界面捕获机制共同控制。我们采用了一种更稳健的方法来改变PDMS芯片的表面性质：在芯片固化期间，向PDMS预聚物中掺杂痕量的PDMS-聚乙二醇（poly(ethylene glycol), PEG）嵌段共聚物（此后称为BCP）。这种策略不需要额外的制造或样品准备步骤，与光学显微镜兼容，并且据报道能为PDMS器件提供超过两个月的稳定表面亲水性。
对比空生长陷阱中的染料强度证实，BCP表面修饰显著降低了所有三种染料的探针滞留。为了直接测试其效果，我们在表达已知12位三进制条形码序列（221221110021）的大肠杆菌测试菌株1上进行了基于组合seqFISH的原位基因分型。结果显示，在未经处理的芯片中，非特异性吸附的探针产生了升高的背景荧光，掩盖了特异性杂交探针的真实信号，导致真实信号与虚假信号的强度相当，在某些情况下甚至导致条形码误判。相比之下，使用BCP处理的芯片，我们获得了明显更清晰的基因分型结果，在所有12个循环中，非特异性结合探针的干扰降至最低。
通过量化每个生长陷阱的信噪比（signal-to-background ratio, S/B），比较未经处理与表面修饰芯片的S/B值，发现BCP处理确实显著提高了所有三种真实数字值（即所有三种荧光染料）的信号质量。由于S/B的提高，条形码误识别的概率显著降低。基因分型程序的延时成像进一步揭示，随着S/B的改善，单个杂交循环（探针结合、洗涤和淬灭）可以在约1小时内高效可靠地完成。这一增强使得在母机中，在连续杂交轮次之间进行探针剥离的组合FISH得以实际应用。例如，使用我们的12位条形码设计，一个完整的12轮原位基因分型程序可以在一夜内完成。
表型记录后质粒扩增实现低扰动的活细胞成像
在解决了母机生长陷阱中非特异性探针聚集的问题后，我们下一步旨在通过使其与低拷贝数质粒兼容来扩展该平台的适用性，这在系统和合成生物学应用中通常是首选。
为实现稳健的条形码表达，同时在活细胞成像期间保持低质粒拷贝数，我们转向了拷贝数可调质粒。其中，拷贝数诱导型触发质粒（copy number-inducible trigger plasmid, pTrig）提供了最宽的动态范围之一。pTrig携带两个复制起点：用于稳定质粒维持的mini-F起点和源自P1噬菌体的、用于质粒拷贝数扩增的oriL。在IPTG诱导下，由lac启动子表达的复制蛋白RepL结合oriL以启动质粒扩增，将每个细胞的质粒拷贝数从约1-3个增加到数百个。
我们将与测试菌株1相同的T7启动子和12位条形码序列克隆到pTrig骨架中，生成测试菌株2。追踪sfGFP时间过程显示，表型记录后质粒扩增可以在IPTG诱导后约6小时内可靠完成，至少80%的细胞成功扩增。此外，在此过程中产生的强sfGFP信号可以在基因分型前通过甲醇（MeOH）固定有效淬灭，确保sfGFP及相关荧光蛋白适合作为活细胞表型报告基因，且不干扰后续的原位基因分型。
组合seqFISH结果表明，表型记录后质粒扩增策略确实为测试菌株2以及已知条形码序列的混合库产生了足够强的荧光信号。对于大多数生长陷阱，可以可靠地进行条形码识别。然而，在大约23%的生长陷阱中，至少8/12位数字（≥67%）被错误分类（S/B < 1），接近随机猜测。仔细检查发现，错误识别数字的最大信号幅度（跨越所有三个探针）显著低于正确识别的数字，并且接近背景水平，表明条形码产量不足。这一发现与sfGFP实验中约20%未显示质粒扩增的生长陷阱一致。在实践中，可以使用强度阈值安全地将此类生长陷阱排除在分析之外。
作为额外检查，我们询问在强T7启动子下表达条形码mRNA是否足以进行可靠的原位基因分型。然而，在没有IPTG诱导质粒扩增的情况下，所有读出探针均未产生高于背景的可检测信号，表明仅靠低拷贝数质粒无法为基于seqFISH的基因分型产生足够的条形码mRNA。
用于筛选亚细胞时空动力学的流线化工作流程
在验证了表型记录后质粒扩增用于原位基因分型的可行性后，我们接下来试图展示整合动态表型记录和原位基因分型的流线化工作流程。与主流技术（如酶标仪检测或DNA测序）相比，基于图像的筛选的一个独特优势是它能同时保留单细胞动态和亚细胞信息。大肠杆菌中的三蛋白MinCDE系统提供了一个理想的测试案例：这个三蛋白网络不仅表现出振荡时间动态，还具有调节细胞分裂位点放置的显著空间模式。具体而言，MinD和MinE蛋白之间的相互作用在细胞内产生所有三种蛋白的极点到极点振荡。因此，由MinD携带的细胞分裂抑制剂MinC显示出时间平均浓度在细胞极点最高、在细胞中部最低的模式，这使得典型的杆状细菌细胞能够进行二分裂并对称分裂。
为了提供完整实验流程的概念验证演示，并说明该平台在筛选动态亚细胞模式方面的潜力，我们对一个小型的、包含四个大肠杆菌菌株的混合库进行了活细胞成像及随后的原位基因分型，这些菌株表达野生型（WT）或MinE的突变变体。点突变被引入MinE的膜靶向序列（membrane-targeting sequence, MTS）内，该区域已知能刺激MinD的ATP酶活性，并且对于正确的亚细胞模式形成至关重要。翻译融合了mKate2的MinC被用作可视化该蛋白质网络动态输出的代理。所有三种蛋白，包括MinE变体和mKate2-MinC，都由pTrig质粒上minCDE操纵子的天然启动子表达。大肠杆菌基因组上的内源性minCDE操纵子被删除，以消除天然表达的Min蛋白的干扰。
活细胞荧光成像揭示了mKate2-MinC不同的时空动态，范围从特征性的极点到极点振荡到几乎不动的斑点。经过表型记录后质粒扩增和原位基因分型，每个生长陷阱的身份得以解析，建立了mKate2-MinC动力学与minE变体之间的一一对应关系。正如预期，表达WT minE的细胞显示出稳健的极点到极点振荡，大约每30秒穿越细胞长度一次，这证实了遗传构建体的完整性和成像系统的可靠性。MinE(L8Y)突变体保留了振荡行为但速度降低，而MinE(F6C)和MinE(N13Q)突变体严重损害了mKate2-MinC的移动性，表明这些残基可能是调控MinCDE动力学的功能热点。
与生物学中许多其他振荡系统一样，例如蓝细菌中的KaiABC生物钟或合成的抑制振荡器，Min动力学的保真度对质粒拷贝数高度敏感。因此，Min系统的可视化通常依赖于从低拷贝质粒表达的荧光标记蛋白。与此一致，我们观察到从中拷贝或高拷贝数质粒表达的Min蛋白完全消除了野生型细胞中特征性的极点到极点振荡，这强调了在表型记录阶段和基因分型阶段需要不同的质粒拷贝数机制。展望未来，我们利用拷贝数可调质粒进行条形码表达的方法，可用于系统性地绘制MinD和MinE中的功能热点图，从而深入了解时空模式形成的稳健性和可调性。
结论
基于图像的表型-基因型筛选是一种新兴方法，它通过同时提供高通量能力、单细胞及亚细胞灵敏度以及精细的时间分辨率，有潜力克服主流方法的关键局限性。然而，尽管前景广阔，这种方法在很大程度上仍未得到充分利用，在基础或应用研究中都未得到广泛采用。在此，通过解决非特异性探针聚集和依赖高拷贝数质粒进行条形码表达的主要问题，我们将其效用扩展到更好地满足更广泛的实验需求，包括在母机中使用组合seqFISH进行快速原位基因分型（每个条形码数字约1小时），以及在活细胞表型记录阶段保持低质粒拷贝数的需求。
应该指出，本文介绍的策略不太可能是唯一可行的解决方案。例如，替代的表面修饰技术，如聚乙烯醇（poly(vinyl alcohol), PVA）沉积，可能提供一种可行的策略来减轻非特异性探针聚集。虽然我们的主要目标是通过读出探针与条形码mRNA的直接杂交来增强基因分型灵敏度，但PDMS器件改进的表面特性也可能支持在母机有限几何空间内进行更广泛的核酸和蛋白质生化反应。例如，以前因探针聚集而受阻的、采用非荧光一级探针和荧光标记二级探针的组合FISH，可能同样受益。此外，除了拷贝数可调质粒，最近的研究表明，染色体编码的条形码可以通过酶催化的滚环扩增（rolling circle amplification, RCA）进行扩增，提供了信号放大和条形码读出的另一可行途径。RCA方法的一个关键优势是其与染色体整合遗传构建体的兼容性，这对于需要精确定量基因表达噪声的应用尤其重要，因为已知染色体拷贝相对于质粒系统能减少外在变异性。同时，RCA涉及多个核酸引物和酶促反应步骤，这增加了实验复杂性、成本以及由于错配模板扩增而导致假阳性信号的易感性。相比之下，我们基于质粒拷贝数的策略提供了一种简单、模块化且无需酶的信号放大方法，可与活细胞成像工作流程无缝集成，同时最大程度地减少对大多数动态筛选应用的表型扰动。
总而言之，这一新工作流程增强了基于图像的单细胞及亚细胞动力学筛选的技术多功能性和流程灵活性，促进了其在基础和合成生物学中更广泛的采用，用于发现和表征从基因表达、细胞周期进程到相分离和亚细胞模式形成等一系列动态现象。
