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《Chemical & Biomedical Imaging》：In Situ Electrochemical Monitoring of Bacillus cereus Biofilm Formation

本文綜述了如何結合非侵入式的電化學阻抗譜 (EIS) 與共聚焦/掃描電鏡等顯微成像技術，實時監測蠟樣芽孢桿菌 (B. cereus) 在金和氧化銦錫 (ITO) 兩種電極材料表面的生物膜形成過程。研究發現，ITO表面更利於生物膜發展，並揭示了生物膜成熟度與電化學信號（如電荷轉移電阻 Rct）下降的直接關聯。該方法為實時、無標記地研究生物膜動態提供了有力工具，對食品、醫療等行業的生物膜防控具有重要意義。

　　

《應用原位電化學阻抗譜與顯微技術監測蠟樣芽孢桿菌生物膜形成：界面動力學與材料效應的關聯分析》

生物膜 (biofilm) 是由微生物及其分泌的胞外聚合物基質 (Extracellular Polymeric Substances, EPS) 共同構成的三維結構群落，廣泛存在於食品加工、醫療器械、供水系統乃至太空探索等領域，因其對環境壓力和抗菌劑的頑強抵抗性而構成重大挑戰。傳統的生物膜檢測方法，如平板計數和微孔板檢測，不僅依賴於細胞的可培養性，也難以實現實時、無損的動態監測。因此，開發先進的無標記 (label-free) 感測技術，如電化學阻抗譜 (Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS)，對於理解生物膜的形成機制和開發防控策略至關重要。蠟樣芽孢桿菌 (Bacillus cereus) 作為一種廣泛分佈的細菌，其生物膜的形成能力與致病性和工業汙染緊密相關，是研究生物膜界面行為的理想模型。

本研究聚焦於利用EIS技術，結合共聚焦激光掃描顯微鏡 (Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM) 和掃描電子顯微鏡 (Scanning Electron Microscopy, SEM)，原位監測B. cereus在金 (gold) 和氧化銦錫 (Indium Tin Oxide, ITO) 兩種電極表面的生物膜形成過程，旨在揭示電極材料表面性質與生物膜結構、電化學行為之間的內在聯繫。

生物膜的生命週期與傳統監測方法的侷限

生物膜的形成是一個循環過程，包括初始附著、成熟和分散三個表型階段。傳統的監測方法如培養計數雖屬常規，但依賴於細胞的可培養性，且無法實時反映生物膜的動態變化。核酸檢測和各種顯微成像技術 (如CLSM和SEM) 雖然在揭示生物膜結構和組成方面發揮著至關重要的作用，但它們通常是終點檢測，或需要複雜的樣品製備，難以連續監測。石英晶體微天平、表面等離子體共振等無標記技術雖能敏感地探測早期附著，但對厚層或成熟生物膜的監測存在侷限。因此，亟需一種能夠實時、非侵入式地表徵生物膜全生命週期的技術。電化學阻抗譜作為一種新興技術，通過測量暴露於細菌培養物的兩個電極之間的電阻抗變化來工作。細菌及其EPS成分作為介電材料，會改變整體阻抗信號，從而實現對生物膜生長、組成和代謝活動變化的實時追蹤。與傳統的單頻阻抗測量（如xCELLigence檢測法，僅提供一個綜合的細胞指數 Cell Index）不同，EIS提供頻率分辨的模型分析，能夠提取諸如電荷轉移電阻 (Charge Transfer Resistance, R_ct) 和恆相位元件 (Constant Phase Element, CPE) 等具體的生物物理參數。

金電極表面的B. cereus生物膜形成動力學

研究首先在金微電極上使用xCELLigence阻抗檢測法，確定了B. cereus生物膜形成的時間尺度。在利於生物膜形成的導電溶液HCT中，細胞指數在接種後12小時達到平臺期，隨後因生物膜脫落而下降。在32小時左右，脫落的部分開始重新生長，並在接種後60小時達到新的平臺期。這種週期性波動表明，金表面上B. cereus生物膜的成熟/脫落週期約為25至30小時。

接著，研究團隊利用非法拉第EIS對絲網印刷金電極 (Screen-Printed Gold Electrode, SPGE) 上的B. cereus生物膜進行了更為細緻的表徵。奈奎斯特圖 (Nyquist plot) 顯示，隨著孵育時間從5小時延長至72小時，阻抗弧的半徑穩步減小，這反映了生物膜生長和成熟過程中電荷轉移電阻 R_ct的下降。在接種後5小時，電極表面僅附著少量細菌細胞時，半圓弧較大，表明 R_ct較高，意味著電極與溶液中的電活性物質之間的電子轉移效率低下。隨著時間推移，細胞增殖和EPS的產生導致 R_ct下降。在56小時和72小時獲得的譜圖能夠被有效擬合，得到 R_ct分別為 (3.8 ± 0.573) × 10⁶Ω 和 (2.6 ± 0.0832) × 10⁶Ω。72小時時的高離散度（32%）暗示了生物膜的異質性和脫落行為。

為驗證B. cereus在金表面的附著和生物膜結構，研究人員使用CLSM對24小時的生物膜進行了三維高分辨率熒光成像。結果證實了B. cereus在金表面形成生物膜的能力，並揭示了其顯著的結構異質性，部分突起結構高度超過20微米。SEM觀察進一步顯示，金電極表面並未被完全覆蓋，生物膜僅在細菌微菌落內生長，並呈現斑塊狀的EPS分佈。觀察到三種主要的結構組織：(i) 可能來源於生物膜分散的孤立浮游細胞；(ii) 纖維狀結構；(iii) 包含緻密EPS、澱粉樣結構和大量孢子的緊湊生物膜。這些纖維狀EPS結構參與了生物膜的空間構建，而孢子形成則表明金環境觸發了應激信號，促進了生物膜內作為適應性生存策略的孢子形成。

ITO電極表面生物膜的電化學與結構表徵

與金電極不同，ITO電極具有光學透明性、導電性和結構均勻性，為同時進行顯微鏡觀察和電化學監測提供了理想表面。研究在LB和HCT兩種培養基中，評估了B. cereus在ITO電極上的生物膜生長，以闡明營養條件對生物膜結構和電化學特性的影響。

在LB培養基中，16小時和24小時生物膜的EIS奈奎斯特圖顯示出兩個明顯的半圓，表明存在緊湊的生物膜以及至少兩個發生在生物膜-電極界面的獨立電化學過程。等效電路模型由一個串聯電阻 R₁和兩個並聯的 R-Q 元件 (R₂–Q₁和 R₃–Q₂) 組成，代表了界面處不同的電化學過程或生物膜層。擬合結果顯示，隨著生物膜成熟，主要變化是 R_ct的降低，16小時後 R_ct值為25413 ± 3360 Ω，24小時後降至22366 ± 3090 Ω。這表明隨著生物膜成熟，質量傳輸效率恢復和/或電極表面細菌細胞組織和EPS產生的介電或導電特性發生變化。

在HCT培養基中，也觀察到了類似的電化學行為。在72小時，半圓的直徑明顯小於20小時記錄的結果，顯示 R_ct在長時間生物膜生長後急劇下降。具體而言，20小時後的 R_ct為118500 ± 11600 Ω，而72小時後則大幅降至12918 ± 2150 Ω，大約降低了九倍。這表明生物膜從一個異質的、部分絕緣的層，演變為一個電化學活性更高、導電性更好的結構，反映了其逐步的成熟和電子傳遞效率的提高。

比較分析：材料表面對生物膜結構的影響

顯微鏡分析清晰地揭示了B. cereus生物膜在金和ITO表面的顯著結構差異。CLSM和SEM結果顯示，24小時時，ITO表面的B. cereus生物膜幾乎沒有觀察到金表面常見的纖維狀結構，且碘化丙錠 (Propidium Iodide, PI) 染色較弱，表明胞外DNA產量和死細胞較少。ITO表面幾乎被密集相關、代謝活躍的固著細胞均勻覆蓋，許多細胞正在進行分裂。此外，在24小時的ITO電極上未觀察到細菌孢子。這些成像上的差異與EIS結果一致，表明B. cereus生物膜在ITO表面的形成比在金表面更為有利。這種差異可能歸因於表面電荷效應或納米結構金表面的抗菌作用。最近一項使用導波超長程表面等離子體共振監測大腸桿菌 (E. coli) 生物膜生長的研究也顯示，二氧化矽 (SiO₂) 表面的生長速率高於金表面，支持了表面性質對生物膜形成有重要影響的觀點。

綜上所述，本研究結合電化學阻抗譜和顯微成像技術，系統地表徵了B. cereus在固-液界面的生物膜動力學。研究發現，電極材料表面性質和孵育時間均顯著影響生物膜的電化學行為。金表面形成的生物膜結構異質，含有大量纖維狀結構和孢子，與較高的 R_ct值相對應。相比之下，ITO表面更利於形成緻密、細胞代謝活躍的緊湊生物膜，這與較低的 R_ct和CPE值相關聯。這些發現突出了生物膜形成的動態特性，並證實了EIS作為一種強大的非破壞性工具，在評估生物膜生長、組織結構和成熟度方面的應用潛力。雖然像xCELLigence這類商業電化學平臺通常採用金微電極進行阻抗監測，但本研究結果表明多孔的金表面可能對生物膜形成有抑制作用，因此在此類設備中也應考慮使用ITO等替代性電活性材料。最終，將EIS與高分辨率顯微鏡技術結合使用，可以全面理解生物膜的結構和發育狀態，為應對生物膜相關挑戰提供更有效的監測和表徵手段。