《Chemical & Biomedical Imaging》：Application of Cumulative Threshold Approaches to Tissue Iron Measurement on Histochemical or Synchrotron X-ray Fluorescence Platforms
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这篇综述性文章深入探讨了在组织化学（Histochemistry）和同步辐射X射线荧光（SXRF）等生物金属成像平台中，应用累积阈值分析（Cumulative Threshold Analysis）方法进行相对定量的优势与潜在陷阱。文章以小鼠脑铁成像为例，系统性地揭示了在ImageJ/Fiji软件中进行图像处理（如位深转换、X轴方向性设定、显示范围调整）时易被忽略的关键问题，并提出了标准化的操作指南，旨在推动更客观、透明和可重复的生物组织铁及其他金属的成像定量分析。
在生物医学研究中，准确量化组织切片中的金属分布，特别是铁元素，对于理解多种生理与病理过程至关重要。当前，组织化学染色（如DAB增强的Perls'染色）和同步辐射X射线荧光（SXRF）等成像技术被广泛应用，但它们通常只能提供相对定量的比较。图像分析的核心挑战之一，在于如何从背景噪声中有效区分出真实的信号。传统的阈值分割方法通常依赖于研究人员主观选择单一的像素强度（PI）截断值，这种方法缺乏一致性，且可能因图像间信号和噪声分布的差异而导致结果不可靠或产生偏差。
为了解决这一问题，Johnson和Walker（2015）提出了累积阈值分析法。该方法不是只用一个阈值，而是评估所有可能阈值下的结果，从而为数据分析提供一个更客观、更全面的强度范围选择依据。然而，在广泛应用的分析软件如ImageJ/Fiji中实施此方法时，存在诸多容易被忽视的陷阱，若处理不当，反而会引入误差或导致无效分析。
本研究以正常和遗传性高铁负荷（Hfe-/-xTfr2mut）小鼠的脑组织切片为模型，分别利用组织化学和SXRF平台获取铁分布图像，深入探讨了应用累积阈值分析时可能遇到的问题。
样本图像与分析
研究分析了来自9月龄对照组和高铁模型组小鼠的脑部图像。组织化学图像显示了整个大脑半球冠状切片的铁染色分布，而SXRF图像则聚焦于第四脑室区域。为了直观展示阈值选择的影响，研究比较了“掩膜”和“反向掩膜”（模板）两种可视化方式。结果显示，使用单一阈值分析一组图像可能并不合适，即使阈值在对照组图像中看似合理，也可能不适用于高铁组图像。不同阈值的选择会显著改变对组间差异的评估结果。
从RGB彩色图像到灰度的转换
将24位RGB彩色图像转换为灰度格式是分析的第一步，但转换方式影响显著。ImageJ提供了两种选项：不选择“加权RGB”时，对红、绿、蓝通道的值进行平均；选择“加权RGB”时，则应用NTSC公式（灰度值 = 0.299 × 红值 + 0.587 × 绿值 + 0.114 × 蓝值）。不同的转换方式会导致像素强度分布发生偏移。此外，ImageJ默认将较低的强度值分配给较暗的像素，这对于信号比背景更暗的组织化学图像是不合适的，需要通过“反转”或“反转查找表”来校正。
累积阈值谱的比较
研究比较了光镜和SXRF图像在不同设置下的累积阈值谱。关键在于，必须根据成像平台正确设置X轴的方向性。对于产生荧光信号的平台（信号比背景亮），ImageJ默认设置（排除阈值以下的像素）是合适的。但对于组织化学图像（信号比背景暗），直接使用默认设置会产生无效结果。解决方法包括排除阈值以上的像素，或者更优选地，在转换为灰度后反转X轴，使信号对应绝对黑色，然后再按常规排除阈值以下的像素。
转换为低位深格式及推荐的范围设置
将图像转换为较低的位深（如从32位或16位转为8位）会不可避免地导致信息丢失。ImageJ默认在线性缩放时，会依据图像的“显示范围”进行转换。如果未意识到这一点，或者没有为分析组中的所有图像统一设置显示范围，就会导致不准确的比较。研究建议，在分析多个图像时，应将所有图像的显示范围和直方图分析范围的最小值设置为0，最大值设置为所有图像中的最高像素强度值，以确保公平比较。
研究还指出，在表示16位数据时，ImageJ默认使用256个箱，这会将数据线性压缩到0-255的尺度上，造成信息损失。应选择使用0-65,535个箱来呈现完整的16位数据，以获得更高的分辨率和更多细节。
面密度图与数据导出
为了更精确地观察数据分布，研究生成了面密度图，比较了8位和16位格式下光镜与SXRF图像像素分布的差异。将分析直方图数据导出至Excel后，首先需要用每个图像感兴趣区域（ROI）的总像素数进行归一化，这对于比较不同尺寸的图像至关重要。研究观察到，高铁小鼠的密度分布峰向更高的像素强度方向移动。
不同阈值选择的差异
研究进一步探讨了为不同实验目的选择不同阈值的影响。例如，在分析含有阿尔茨海默病相关淀粉样斑块（被铁染色）的皮质区域时，发现一个适合对照组图像斑块识别的阈值（如PI 75），可能不适用于整体染色更强的高铁组图像，反之亦然。这凸显了即使在同一研究中，针对不同的分析目标（如选择所有纤维结构还是仅选择深染的斑块），也可能需要采用不同的阈值。此外，使用NTSC公式与使用RGB通道平均值进行灰度转换，在统计分析结果上也可能产生差异。
总结与推荐指南
综上所述，累积阈值分析是一种强大的图像分析策略，但研究人员必须警惕所用软件的特性和潜在陷阱。虽然8位格式适用于许多情况，但建议在分析前检查使用更高位深格式是否会显著影响结果。文章最后提出了六条关键的操作指南：
- 1.
在修改图像前，在“转换”选项中选中“转换时缩放”。
- 2.
将RGB图像转换为灰度时，在“转换”选项中取消选中“加权RGB转换”（即使用颜色通道的平均值）。
- 3.
在RGB转换为灰度后，立即根据平台特性校正X轴方向性。
- 4.
在转换为低位深格式或生成分析直方图前，将所有待分析图像的“亮度/对比度”显示范围最小值设为0，最大值设为图像组中的最高强度值。
- 5.
生成分析直方图时，确保ImageJ在“直方图”对话框中自动填充的设置已根据分析需求进行了适当修改。
- 6.
所有用于阈值分析和图像量化的步骤和设置都应透明报告，并附上选择特定阈值或阈值范围的标准。
讨论与展望
本研究证实了累积阈值方法在金属分布图像（以铁为例）面密度半定量评估中的价值。然而，分析结果会受到成像平台、样本类型和研究目的的显著影响。高位深格式（如16位）虽然可能不总是改变统计显著性，但能提供更丰富的数据分布细节，减少高强度端的饱和效应。未来，需要将此方法与能结合标准品的绝对定量方法（如定量磁化率图QSM）进行验证，并探索结合图像分割、MATLAB、Python编程或机器学习技术，以自动化工作流程，提高32位及以上格式数据分析的准确性和效率。
最终，本研究支持Johnson和Walker的建议，即研究人员在进行数字化图像的半定量比较时，应研究、绘制并报告在整个数据范围内进行累积阈值选择和分析的完整细节与效果，以促进对单阈值或多阈值选择策略背后原理及有效性的评估。通过警惕并妥善处理文中指出的各种陷阱，累积阈值分析能够成为一种推动生物金属成像研究走向更客观、更可靠的重要工具。
