用于高剪切输送的负载细胞的超分子及共价聚合物水凝胶：实验设计方法

《Chemistry of Materials》：Cell-Laden Supramolecular and Covalent Polymer Hydrogels for High-Shear Delivery: A Design of Experiments Approach

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细胞递送支架的有效设计对再生医学技术充分发挥其潜力至关重要，尤其是在将细胞递送到结构复杂的伤口或直接注入生物环境时。然而，很少有研究系统地探讨细胞、聚合物支架以及这种复合材料的最终生物特性的相互作用。在这项工作中，我们报告了一种由离子交联肽两亲体（PA）纳米纤维组成的超分子水凝胶的系统分析结果，该水凝胶经过优化，可以实现高剪切力下的细胞递送，并将其性能与离子交联海藻酸盐的共价聚合物水凝胶进行了比较。通过全因子实验设计（DoE），我们研究了聚合物浓度与细胞装载量之间的相互作用，以确定它们对水凝胶机械性能、结构完整性、基底粘附性和喷雾性能的影响。超分子水凝胶的剪切变稀和触变性质使其能够通过喷雾喷嘴进行有效沉积，而海藻酸盐水凝胶则无法实现这一点，同时保持了细胞的存活率和水凝胶的机械性能。PA纳米纤维的超分子骨架即使在细胞装载量高达200万细胞/毫升的情况下，也表现出显著的机械弹性并在喷雾后的结构完全恢复，而海藻酸盐水凝胶在相同细胞装载量下则出现了明显的凝胶完整性损失。我们的发现建立了一个稳健的结构-性能关系框架，用于开发能够在高剪切力下递送细胞的水凝胶，这突显了它们在再生医学、先进伤口护理和3D打印应用中的潜力。

**引言**
活细胞的递送是再生医学许多新兴战略的基础，但将脆弱的细胞输送到目标组织仍然是一个巨大的挑战。(1?4) 注射、喷雾沉积和基于挤出的生物打印等方法虽然承诺实现微创递送和精确的空间控制，但会使聚合物水凝胶支架和嵌入的细胞暴露在极端的机械应力下。选择用于高剪切力细胞递送的聚合物载体是一个多方面的挑战，因为材料必须同时具备生物相容性和适当的流变性能，以在沉积过程中保持结构完整性。(5,6) 粘度、凝胶硬度、剪切变稀行为和交联动力学是考虑这些水凝胶材料进行注射、挤出或喷雾递送时的关键参数。(7?12) 通过剪切实现的溶胶-凝胶转变取决于生物材料在剪切作用下分解和流动的能力，以及沉积后快速重新形成凝胶的能力。(13,14) 此外，快速原位凝胶化的能力对于保持支架的微观结构和水凝胶的功能，从而支持细胞定位和再生潜力至关重要。(14,15) 因此，在高剪切力下保持材料完整性和细胞存活率已成为这些再生方法转化的核心障碍。尽管基于细胞的疗法发展迅速，但在理解水凝胶力学与细胞装载量之间的相互作用如何影响高剪切力递送性能方面仍存在重大缺口。(5,6,16?21) 结合可调屈服应力和自修复动力学的设计策略为开发既高度可注射又具有机械弹性的水凝胶提供了途径，满足了体内递送和长期功能的双重需求。(8,22?25) 将细胞递送到宿主材料中，或者说是细胞负载的水凝胶，已成为最近的研究热点，因为它提供了将细胞递送到损伤部位或需要部位的稳定平台。(26?29) 集成细胞的聚合物生物墨水的3D打印特别受到关注，因为它能够指定细胞外特征和细胞组织，从而增强对组织制造策略的控制，以及新兴的类器官开发领域。(30?34) 尽管如此，这些研究中的大多数和其他领域的研究仅关注细胞递送和组织再生的生物学结果，而没有探讨其对基本材料性能的影响。当用大量细胞或填充剂加载基质时，由于填充剂聚集破坏了基质的均匀性，预计凝胶硬度和其他依赖于网络完整性的性能会下降。(35?39) 由于细胞的非线性机械特性和体积，它们可能会破坏水凝胶网络的交联，进而影响其结构完整性，导致硬度降低和流变行为改变。(38,40) 通过喷雾和3D生物打印实现细胞负载水凝胶的高剪切力递送是一个新兴领域，但高剪切力对材料完整性和维持细胞功能的影响尚未得到充分了解。(41?43) 喷雾沉积和基于挤出的打印都会使这些生物材料经历高剪切力，但要求不同：喷雾递送侧重于雾化和不规则表面上的快速原位重组，而挤出则需要丝材稳定性和图案保真度。在这两种情况下，材料都必须在剪切作用下液化，同时迅速恢复以保护细胞并保持几何形状。喷雾递送提供了一种实用的方法，可以以最小的侵入性将细胞和基质应用于大面积或不规则的伤口。可喷涂的纤维蛋白-角质形成细胞悬浮液已经证明了其可行性，因为它增强了细胞保留和伤口覆盖，但这些系统主要是粘合性的，缺乏引导长期再生所需的结构和生物活性复杂性。(44?49) 同样，基于挤出的3D打印水凝胶生物墨水也会使细胞负载的配方经历高剪切力环境，需要能够暂时液化以便沉积的同时迅速恢复结构完整性，以保持细胞存活率和空间保真度。(50?55) 当粘度、剪切变稀响应、屈服应力或凝胶化/恢复时间超出加工窗口时，材料容易发生喷嘴堵塞、丝材塌陷、图案保真度下降和细胞存活率降低，这些现象在挤出及相关的水凝胶打印方法中反复出现。(28,55?58) 这些限制不仅影响可打印性；它们还决定了部署后是否能够保持空间提示、机械支持和有效载荷定位。(27,57) 如Bertsch等人指出的，自修复可注射水凝胶处于再生医学的前沿，因为它们在剪切作用下能够液化并随后恢复，从而实现最小侵入性的、针对患者的递送和持续的组织修复支持。(59) 因此，下一代基质应该具备加工感知的流变学特性，结合显著的剪切变稀和快速自修复能力以及可调的机械性能，以便优化沉积和功能。

**肽两亲体（PA）超分子聚合物和海藻酸盐**
肽两亲体（PA）超分子聚合物和海藻酸盐代表了两种不同的水凝胶设计范式，它们为高剪切力下的细胞递送提供了互补的机会。PA的超分子聚合物通过疏水崩塌、β-折叠氢键和单体之间的静电相互作用自组装成纳米纤维。(60?62) 它们的非共价组装和离子介导的交联产生了动态的剪切变稀水凝胶，这些水凝胶在应力作用下会液化，但在停止剪切后能迅速恢复，从而实现微创注射或喷雾递送。这种动态性质使它们成为喷雾或注射递送应用的理想候选材料，便于在高剪切力后进行微创给药。(63?65) 这些水凝胶表现出可调的机械性能，并已应用于多种领域，从3D生物打印墨水(66,67)到组织再生支架(61,68,69)。相比之下，海藻酸盐是一种通过二价配位形成离子交联网络的共价多糖。(70?74) 海藻酸盐是一种线性多糖，由1→4连接的β-D-甘露糖酸（M）和α-L-古洛糖酸（G）残基组成，排列成均聚M块和G块以及交替序列。块组成决定了离子结合和凝胶结构：连续的G块采用刚性构象，在协同的“蛋盒”接头中配位二价阳离子，产生密集的交联区和机械强度高的网络，而更灵活的M块则弱结合阳离子，导致更大的膨胀和更软的凝胶。(75,76) 海藻酸盐水凝胶已广泛应用于组织再生和3D生物打印，使其成为广泛使用的基准材料。(30,38,70) 尽管如此，很少有研究系统地探讨高细胞装载量和离子环境如何改变这两种系统的凝胶性能。因此，直接比较PA和海藻酸盐提供了独特的时机，以揭示由骨架化学控制的细胞负载水凝胶的性能结构-性能关系，从而影响其高剪切力递送的效果。

**本工作的目标**
本工作的目标是了解基质浓度和细胞浓度之间的相互作用如何影响生物材料性能，同时在高剪切力递送过程中保持细胞存活率。为了识别可变相互作用和影响因素，可以使用全因子实验设计（DoE）方法实施质量优化过程。全因子设计是一种实验方法，用于检查多个因素及其水平的组合，从而更好地理解整个设计空间。(77,78) 在DoE框架内，一个因素代表正在研究的实验变量（例如浓度、pH值、温度），而一个水平对应于测试该因素的具体值或条件。这种方法对于理解变量之间的相互作用至关重要，因为它可以观察一个因素的效果如何依赖于另一个因素的水平。识别这些相互作用至关重要，因为它们可以揭示在单独研究因素时可能不明显的协同或拮抗效应。(79,80) 尽管共价和超分子水凝胶在细胞递送中得到广泛应用，但对于这些聚合物材料如何适应高细胞负载的直接比较却很少。共价聚合物（如海藻酸盐）形成稳定的离子交联网络，而PA则通过非共价相互作用组装成高度动态的超分子基质。预计这两种不同的范式会对细胞装载产生不同的流变响应，但这一点尚未得到系统研究。在这里，我们应用全因子DoE框架来比较不同基质和细胞浓度下的海藻酸盐和PA超分子聚合物，确定结构-性能关系，揭示材料化学如何控制注射性、恢复性和完整性。这些见解为优化适用于喷雾和注射递送平台的细胞负载水凝胶提供了设计规则，以用于未来的组织再生应用。

**材料与方法**
乙腈、二氯甲烷（DCM）、N,N-二异丙基乙胺（DIEA）、N,N-二甲酰亚胺（DMF）、二乙醚、甲醇、4-甲基吡啶和氢氧化钠（NaOH）均从Sigma-Aldrich购买并按原样使用。棕榈酸从Acros Organics购买并按原样使用。所有Fmoc保护的氨基酸、Oxyma和Rink酰胺MBHA树脂均从CEM购买。三异丙基硅烷（TIPS）、三氟乙酸（TFA）、Dulbecco改良的鹰培养基（DMEM）、热灭活的胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素、CyQUANT乳酸脱氢酶（LDH）测定和活/死细胞成像试剂盒均从ThermoFisher购买。无菌的6孔和96孔板从CellTreat（美国）购买。海藻酸钠纯度为95%的产物从MPBio购买。所有其他化学品均从ThermoFisher购买。培根脂肪和鸡腿肉从Winn Dixie购买。

**肽两亲体（PA）合成**
本研究中使用的PA（肽序列C16V3A3E3）采用标准的固相Fmoc肽化学法合成。PA在Rink酰胺MBHA树脂（EMD）上合成，氨基酸偶联在CEM Liberty Blue微波辅助肽合成仪（CEM，Matthews，北卡罗来纳州）上进行。Fmoc基团使用20%的4-甲基吡啶在N,N-二甲酰亚胺（DMF）中于90°C下处理30秒进行切除。氨基酸偶联使用4摩尔当量的Fmoc保护的氨基酸、8摩尔当量的乙基氰羟基亚氨基乙酸（Oxyma）和8摩尔当量的N,N′-二异丙基碳二亚胺（DIC）在50:50 DMF溶剂中于90°C下处理2-4分钟。使用相同的程序，将棕榈酸（C16）偶联到肽的N端作为疏水尾部。

完成的PA分子使用95:2.5:2.5的三氟乙酸（TFA）/三异丙基硅烷（TIPS）/水的溶液在室温下在腕式振荡器上处理2-3小时进行切割。切割后，用冷二乙醚沉淀，通过离心收集并过夜干燥。然后使用Phenomenex Gemini柱（C-18固定相，5 μm，100 ?孔径，50 × 250 mm）进行制备级反相高效液相色谱（CEM Prodigy HPLC）纯化。移动相为含0.1%氢氧化钠的乙腈和水。纯化成分使用ThermoScientific Orbitrap ExplorisTM 240质谱仪在负离子模式下通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）鉴定。多余的乙腈通过旋转蒸发去除并冷冻干燥，粉末在-20°C下保存直至使用。

**液相色谱-质谱（LC-MS）**
合成的PA的纯度通过液相色谱-质谱（LC-MS）确认，该方法使用Agilent 1200系统和Phenomenex Gemini C-18柱（100 × 1.00 mm；5 μm）在碱性条件下进行。质量检测器（MS）为Agilent 6520 Q-TOF MS。所有梯度方法均按照以下步骤进行：首先使用50 μL/min的流速将乙腈浓度调整至5%并保持5分钟；接着在25分钟内将浓度从5%逐步增加到95%，同样保持50 μL/min的流速；最后再次使用50 μL/min的流速将浓度维持在95%并保持5分钟。为了实现碱性条件，在所有溶剂中加入了氢氧化铵（0.1% v/v）。检测峰的波长为λ = 220 nm。

**肽两亲性分子的制备**
将冻干后的粉末重新溶解于去离子水中，浓度调至1 wt%，然后使用NaOH将pH值调整至7.4。随后将溶液分装并冻干，并在-20 °C下保存以备后续使用。

**制备载有细胞的Hydrogels**
将聚合物样品溶解至所需最终浓度的两倍，并与含有钙和细胞的凝胶溶液按体积比1:1混合。充分混合后，所得Hydrogels将达到预期的最终聚合物、钙和细胞浓度。使用前，样品需在室温下凝胶化15分钟。

**钙的含量测定**
按照上述方法，在96孔板中的孔内制备含有0.25%、0.5%和1.0%钙的Hydrogels（每孔100 μL），然后进行离子交联。加入磷酸盐缓冲盐水（PBS，100 μL），并在37 °C下孵育。在指定时间点（0-72小时）收集孵育液并更换。 samples在-20 °C下冷冻，直至动力学过程完成，解冻后使用Arsenazo III试剂测定Ca2+浓度。在微酸性条件下，金属显色剂Arsenazo III会与钙结合形成有色复合物，该复合物在650 nm处的吸光度与样品中的Ca2+含量成正比。将Arsenazo III试剂（在0.1 M咪唑缓冲液中制备，pH 6.8，浓度为0.2 mM）直接加入20 μL的样品中，用涡旋混合器剧烈混合10秒后，测量其在650 nm处的吸光度。通过与从0到10 mM的CaCl2(aq)标准品制备的标准曲线进行比较，可确定最终的Ca2+浓度。

**流变测量**
使用配备25 mm圆锥-平板钢几何结构的ARES流变仪（TA Instruments）进行流变测量，保持间隙高度为0.25 ± 0.05 mm。为了评估离子交联对聚合物样品粘度和模量的影响，先在钢板上放置300 μL的聚合物溶液，然后加入等体积的凝胶溶液并充分混合。使用1 mL注射器彻底混合样品，使其凝胶化15分钟。凝胶化后，通过从0.01%到100%的动态应变扫描（固定频率为1 Hz）确定每个样品的线性粘弹性区域（LVR）。在所有样品的LVR范围内，进一步进行从1到100 rad/s的动态频率扫描。通过施加高应变（超出LVR的400%）和低应变（在LVR范围内的0.01%）来评估触变性。每次测试持续60秒，应变是手动切换的。整个过程中板子保持关闭状态，转变过程相对较快。

**扫描电子显微镜（SEM）**
使用导电碳带制备SEM样品支架。对于沉积样品，将等量的聚合物和40 mM氯化钙溶液涂覆在支架上。样品凝胶化后，将其浸入液氮中直至完全冻结（约30秒），然后进行冻干。对于喷涂样品，将聚合物和凝胶溶液按等体积混合后喷涂在支架上，使其固化，随后进行冻干。使用Zeiss Sigma VP场发射扫描电子显微镜进行分析。

**冷冻透射电子显微镜（CryoTEM）**
使用PELCO easiGlow系统（Ted Pella, Inc., Redding, CA, USA）对300目铜网（带有网状碳膜的碳纤维）进行30秒的辉光放电处理。样品在真空下预处理至0.1 wt%的聚酸（PA）浓度，然后使用Vitrobot Mark IV（FEI）玻璃化机器人进行玻璃化处理。将7 μL的样品溶液转移到经过等离子体清洗的300目铜网上，并进行 plunged-freezing处理。样品在95-100%的湿度下在室温下放置，然后浸入液氮中，并通过cryo-transfer阶段转移到Gatan 626冷冻保持器中。使用液氮冷却的JEOL 1230 TEM（加速电压为100 kV）进行冷冻TEM成像，图像由Gatan 831 CCD相机获取。

**粘附性测试**
粘附性测试依据ASTM F2258和D4541标准进行，使用配备25 N负载传感器的Mark-10 EasyMESUR Test（型号F105）进行。每个Hydrogel样品的最终体积为0.3 mL，在充分混合聚合物和凝胶溶液后使用。在两个玻璃基底之间进行定制的拔离测试，施加的力为0.16 N，拔离速率为13 mm/min。测试过程中，铝制载物的底部用商用氰基丙烯酸酯粘合剂固定了玻璃盖片。作为底部接触面的玻璃显微镜载片涂有培根脂肪，该载片固定在为测试仪器底部设计的3D打印结构上。记录的最大拉力为分离粘合接头所需的力。

**喷雾分析**
为了分析样品的喷雾覆盖能力，使用了Spot-On纸（Innoquest Inc.）。喷雾体积固定在每80 cm2卡片使用1 mL。从约10 cm的距离进行喷雾，操作者手动控制注射器的压力。分别制备聚合物溶液和凝胶溶液，等体积混合后在Eppendorf管中充分混合并凝胶化15分钟，然后吸入注射器中并进行喷涂。喷雾后获取图像，通过ImageJ软件进行阈值处理以区分湿润的Spot-On纸（蓝色）和干燥的部分（黄色），从而确定面积覆盖率。

**组织模拟（用于喷雾或注射）**
为了评估这些材料作为喷雾或注射剂的适用性，使用鸡腿作为喷涂或注射的基底模型系统。聚合物溶液与凝胶溶液混合后，加入2 μL的蓝色食用色素。样品通过18 G针头或注射喷嘴进行喷射。

**细胞培养维护**
人类胚胎肾细胞（HEK 293）在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，培养条件为37 °C和5% CO2。当培养瓶中的细胞密度达到80%时进行收获。

**细胞毒性**
使用胰蛋白酶-EDTA溶液从培养瓶中收集细胞，然后用富集的DMEM稀释，并进行离心。获得的细胞沉淀重新悬浮在富集的DMEM中，稀释至1 × 10^5细胞/mL的浓度，通过台盼蓝染色和Invitrogen Countess细胞计数器确认浓度。将超分子聚合物在96孔板中以0.25%、0.5%或1.0%的浓度（含20 mM CaCl2）凝胶化。细胞轻轻涂覆在凝胶上并孵育。细胞在37 °C和5% CO2条件下孵育48或72小时。同时设置了一个自发对照组，其中培养基仅更换为超纯过滤水。暴露后，根据Invitrogen CyQUANT试剂盒的说明书进行乳酸脱氢酶（LDH）检测，并根据公式（1和2）计算细胞毒性百分比。

**细胞成像**
为了观察细胞活力的影响，还使用了ThermoFisher Live/Dead Cell Imaging试剂盒进行活细胞/死细胞成像。细胞按照上述方法培养，但培养在玻璃底的96孔板中。48小时后，从每个孔中去除50 μL的上清液，然后加入50 μL的Live/Dead染色剂。细胞在室温下孵育15分钟，随后在Leica STELLARIS STED Super-Resolution共聚焦显微镜上进行成像。

**喷雾输送后的细胞活力**
按照Wood等人的方法（81），评估喷雾输送后HEK 293细胞的活力。简要来说，HEK293细胞以2 × 10^5细胞/mL的浓度悬浮在Ringer缓冲液中，与Ringer缓冲液或PA超分子聚合物Hydrogel（1 wt%）按体积比混合，最终细胞浓度为1 × 10^5细胞/mL，PA浓度为0.5 wt%。样品使用1 mL注射器喷嘴进行喷射，孵育后的细胞活力通过台盼蓝染色并使用血细胞计数器手动计数，分别在喷雾前、喷雾后5分钟、24小时和72小时进行评估。每个悬浮液取三份样本进行计数，每个样本重复三次实验，计算平均细胞计数和标准偏差。

**结果与讨论**
本研究使用单一的聚酸（PA）单体来研究细胞负载对制备的Hydrogels自组装和机械性能的影响。PA单体包含一个疏水性的棕榈酸尾部，该尾部促进核心的疏水性塌陷；三个丙氨酸和三个缬氨酸残基通过氢键维持分子间凝聚力；三个谷氨酸残基提高水溶性（图1a）。这种PA单体的超分子聚合已得到充分验证，可形成高长径比的纳米纤维，这些纳米纤维能够交织成三维支架，支持组织再生（82-84）。单体通过自动化固相肽合成制备，其纯度通过高分辨率液相色谱-质谱（LC-MS，图S1）确认。

**实验设计（DoE）方法**
采用了两两配对的、三水平的完全因子设计（DoE），重复三次，系统地探究了基质浓度和细胞浓度之间的关系，分别针对共价交联的海藻酸Hydrogels和超分子PA纳米纤维Hydrogels。虽然传统的三水平因子设计通常采用等间距的因子水平（低、中、高）以确保正交性和最大化统计效率，但本研究有意采用非等间距的水平，以更准确捕捉材料在实际应用条件下的性能边界。在PA纳米纤维Hydrogels中，浓度低于0.25 wt%时，得到的凝胶结构不规则且力学性能较弱，无法有效评估细胞-基质相互作用；而浓度超过1 wt%时，虽然材料需求增加，但收益却很有限。因此，所选因子水平是有意偏向于两个系统都表现出结构稳定且生理相关行为的浓度范围的，从而能够在设计空间中最有信息量的区域内对材料-细胞相互作用进行更高分辨率的评估（表1）。为了调整这种非正交性，使用方程3对因子水平进行了编码。??coded=?????centerhalf?rangexcoded=x?xcenterhalf?range（3）表1. 实验设计和自变量及响应的数值及水平决定因素codelower levelcoded low inputmiddle levelcoded middle inputupper levelcoded upper level聚合物浓度（重量百分比）X10.25–10.5–0.3311细胞浓度（细胞/mL）X21 × 105–11 × 1060.05262 × 1061这种将变量编码为无量纲形式的做法是必要的，以减少尺度差异，增强回归矩阵的数值条件，并在缺乏严格正交性的情况下保持估计效应的可解释性。流变稳定性通过将相邻纳米纤维上的谷氨酸的γ-羧基与二价阳离子（如钙）螯合，可以离子交联缠结的聚酰胺（PA）纳米纤维，从而调节水凝胶的粘度和硬度，形成离子交联的超分子聚合物基质。在超分子水凝胶的凝胶化过程中，钙作为纳米纤维之间的静电桥梁，调节纤维间的相互作用和系统的整体网络结构。（82,85,86）为了评估细胞-水凝胶相互作用对超分子水凝胶机械性能的具体影响，在PA和水藻酸盐系统中形成水凝胶的过程中，我们保持了20 mM的恒定氯化钙（CaCl2）浓度。选择这个浓度是为了在低和高超分子聚合物浓度下实现谷氨酸残基的部分饱和，确保我们计划研究的任何水凝胶都不会完全交联。为了确认这一点，我们进行了频率扫描，以确定在不同聚合物浓度下增加CaCl2浓度时的粘度和硬度，结果发现当CaCl2浓度超过大约50 mM时，凝胶性质没有显著改变（图S2和S3）。因此，我们确定在恒定的20 mM CaCl2浓度下工作，可以比较细胞负载对水凝胶的影响。这种方法能够分离出细胞对水凝胶机械性能的特定贡献。钙定量分析显示，无论PA浓度如何，超分子水凝胶最初都会释放约10 mM的Ca2+，这与易于交换到接收溶液中的松散结合部分一致（图S4）。当释放接收溶液定期用新鲜缓冲液补充以达到近似无限稀释的条件时，出现了一个较慢的、依赖于浓度的释放曲线，其中较低的PA浓度最初释放了更多的钙，反映了螯合能力的降低。大约5小时后，释放速率趋于平稳，并在几天内保持这一水平，表明存在一种在生理条件下稳定的协调部分，足以维持网络完整性，突显了所有水凝胶之间的负载相似性（图S5）。为了评估细胞负载对水凝胶粘度的影响，我们对每个条件进行了0.5%应变的频率扫描。两种超分子聚合物和共价水藻酸盐对照都表现出剪切稀化行为，这与剪切作用下离子交联的破坏一致（图S6）。增加超分子聚合物浓度使所有剪切率下的粘度上升，反映了更密集的网络形成，而细胞包含并未显著改变这一曲线。相比之下，水藻酸盐水凝胶明显依赖于细胞负载，尤其是在较高重量百分比的配方中，粘度随着细胞浓度的增加而降低（图S6）。这种降低可能是由于细胞取代了基质，限制了交联以及共价骨架适应这种取代的能力。超分子系统动态的、纤维桥接的架构可以在不破坏网络完整性的情况下容纳细胞的加入，这与更刚性的共价水藻酸盐网络不同。（87,88）传统上使用蛋盒模型来描述二价金属离子（如Ca2+）如何与相邻的G-blocks协调，与水藻酸盐形成三维凝胶网络。（89?91）共价骨架的刚性和G-blocks的高度特异性结合，使得水凝胶的流变响应不如PA超分子聚合物水凝胶，从而产生了一个不太动态的水凝胶。为了评估含细胞负载的PA超分子聚合物水凝胶的结构完整性，我们进行了进一步的流变分析以确定LVR（线性粘度-应变关系）。值得注意的是，细胞包含的变化并未显著影响生物材料的交叉点或平台模量（图S7），这表明细胞的加入不会损害动态水凝胶网络的机械稳定性。随后通过0.5%应变的频率扫描进行了模量影响的测量，确保测量结果保持在LVR范围内（图S8）。PA超分子聚合物水凝胶在细胞浓度增加时，交叉点、平台模量或频率依赖行为的变化都很小，表明它们的动态、纤维桥接架构可以在不损失硬度的情况下容纳细胞的加入。相比之下，我们观察到所有离子交联水藻酸盐水凝胶的模量都有显著下降，且在较高聚合物浓度时这种效应更加明显。我们假设这种水凝胶网络的削弱是由于Ca2+介导的交联在刚性多糖骨架中的几何破坏，因为密集排列的细胞取代了基质并阻碍了接头的形成（图2和S8）。在1 Hz时，没有任何超分子聚合物水凝胶显示出相对于无细胞对照的统计显著硬度损失，表明纤维支架可以动态重排以保持材料的完整性。总体而言，这些结果突显了动态超分子网络相对于其共价对应物在高填充物含量下的更大韧性。我们将PA的韧性归因于其动态的、静电桥接的超分子纤维网络，该网络在应力下可以快速、可逆地重新组织，从而在细胞加入引起的局部破坏后恢复。相比之下，共价水藻酸盐聚合物的离子交联结构依赖于离散的、刚性的G-block接头区；细胞的位移不可逆地破坏了这些接头，可能降低了整体交联密度。这种微观结构的敏感性解释了水藻酸盐凝胶中明显的模量损失，并支持了一个精细的设计原则：在高填充物负载下，细胞在水凝胶网络中充当机械缺陷，整体材料性能取决于网络在宏观尺度上重新分配应力和容忍缺陷密度的能力。虽然两个系统都依赖于可逆的离子相互作用，但结合了冗余交联和动态可重构纤维骨架的超分子水凝胶表现出更好的缺陷容忍度和机械恢复能力，能够在高剪切加工条件下保持整体性能，这是离子交联共价聚合物网络所无法实现的。图2图2. 作为基质浓度和细胞负载函数的硬度的流变分析。对含细胞负载的水凝胶进行了从1到100 rad/s的动态频率扫描，以确定细胞负载对硬度的影响，其中1 Hz的数据点被单独取出进行分析。(a) 1 Hz时随细胞浓度增加的超分子聚合物水凝胶的G′。(b) 1 Hz时随细胞浓度增加的水藻酸盐凝胶的G′。数据以平均值±标准差显示，最少n = 3次独立实验。* 表示p < 0.05。统计显著性使用单因素ANOVA确定，并通过事后Tukey检验进行均值比较。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片水凝胶粘附评估在组织工程中，支架对伤口床的粘附是一个关键的设计约束，影响整合、机械稳定性、应用便利性以及最终的再生结果。我们假设将细胞纳入所有水凝胶网络会破坏网络完整性并降低对基底的粘附力。尽管添加了高填充物浓度，但凝胶的网络结构和机械性能基本上保持不变。因此，粘附测试作为一个正交的衡量标准，反映了聚合物的包装和网络完整性的保持。为了评估粘附力，首先将玻璃基底涂覆上猪油脂肪（即脂肪涂层），以模拟深层真皮或全层皮肤损伤的富含脂质的表面化学特性，然后使用含细胞负载的水凝胶进行粘附剥离测试（图3a,b）。为了确保力头的敏感性，我们首先通过比较交联前后的PA超分子聚合物在脂肪涂层表面进行了验证。随着未交联聚合物浓度的增加，与基底的相互作用也增加，导致粘附力增加。在离子交联后，谷氨酸残基的羧基在凝胶网络中被占据，从而减少了它们与基底表面的相互作用。虽然通常认为PA纳米纤维的粘附主要由表面羧酸与羟基化基底之间的氢键主导，但我们观察到只有在羧酸盐自由的情况下，其对脂肪涂层表面的粘附力才会增强。交联导致粘附力依赖于细胞浓度或基质重量百分比的固体含量的变化可以忽略不计，但与未交联聚合物相比有所改善（图3c）。在数据收集之前，研究了系统的限制及其与脂肪基底的相互作用，以确保实验设计的稳健性，并确保涂层基底或交联对结果没有影响，在材料交联后观察到脂肪涂层对结果的影响可以忽略不计（图S9）。有趣的是，尽管它们的结构组成有显著差异，两种水凝胶对脂肪涂层的粘附力却非常相似（图3d–f）。只有在低和中等重量百分比配方以及纯0.5 wt %基质比较中，PA和水藻酸盐基质对脂肪涂层的粘附力在最高细胞负载时观察到统计显著差异。这一观察结果强调了水凝胶粘附机制的复杂性，这些机制不仅受表面化学的影响，还受到水凝胶微观结构的影响。这些发现突出了水凝胶粘附的多因素性质，其中仅表面化学不足以预测性能。相反，网络架构、交联密度和膨胀行为之间的相互作用决定了可用的界面结合模式及其形成稳定粘附接触的能力。图3图3. 对脂肪涂层基底的粘附特性描述。图像显示了（a）未交联和（b）交联的超分子聚合物在脂肪涂层玻璃表面上进行的剥离测试。（c）未交联和交联的PA超分子聚合物的剥离测试粘附力。（d）0.25 wt %含细胞负载水凝胶的剥离测试粘附力，（e）0.5 wt %含细胞负载水凝胶的剥离测试粘附力，以及（f）1.0 wt %含细胞负载水凝胶的剥离测试粘附力。* 表示在GraphPad Prism中使用单因素ANOVA和事后Tukey检验进行均值比较时，PA和水藻酸盐超分子聚合物数据点之间的p < 0.05。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片喷雾分析和水凝胶输送演示通过喷雾输送含细胞负载的水凝胶为治疗复杂伤口提供了一种有前景的方法，有助于促进细胞在伤口床的定位，并可能加速愈合过程。为了评估这种输送方法对我们生物材料的有效性和精确性，我们使用了主要在农业环境中使用的Spot-On纸（一种对水敏感的基底）来评估喷雾沉积，并结合了图像分析技术。湿润后，Spot-On纸在与水凝胶接触的区域从黄色变为蓝色，提供了沉积区域的视觉表示。这种比色变化使我们能够量化喷雾覆盖范围和均匀性，确保在模拟的伤口处应用的一致性。固定的沉积区域和喷雾体积参数允许进行受控实验，从而确保评估水凝胶性能的可重复性和可靠性。尽管共价和水藻酸盐水凝胶都是离子交联的并且具有剪切稀化特性，但只有超分子聚合物能够通过喷嘴有效喷涂，并保持一致的高表面积覆盖（图4a,b）。无论聚合物浓度如何，即使在我们的DoE中评估的最高细胞包含量下，也实现了成功的喷雾覆盖（图4c）。图4图4. 含细胞负载水凝胶的喷雾性表征。在（a）低聚合物浓度和（b）高聚合物浓度下，含细胞负载水凝胶的喷涂面积覆盖。代表性的Spot-On纸图像（黄色=干燥，蓝色=湿润），显示了（c）对照组，（d）低聚合物、低细胞负载条件，以及（e）高聚合物、高细胞负载条件的超分子和水藻酸盐水凝胶的喷雾。离子交联的超分子聚合物（f）在喷雾输送前后的代表性扫描电子显微镜图像（g）。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片。这种超分子聚合物水凝胶通过喷雾的高剪切力有效从凝胶状态转变为溶液状态，并在沉积后迅速重新形成水凝胶结构。离子交联的水凝胶在通过喷嘴时由于高剪切力而受到破坏，导致超分子聚合物的解缠。无论基体浓度或填料掺入量如何，这种超分子水凝胶都能覆盖超过80%的指定基底面积（图4a,b）。藻酸盐水凝胶可以在较低的聚合物浓度下进行喷雾，随着细胞浓度的增加，基底覆盖面积也有所增加（图4a）。然而，随着藻酸盐水凝胶中聚合物浓度的增加，喷雾覆盖面积显著减少，尤其是在与PA超分子聚合物水凝胶的相应条件下（图S10）。从根本上说，细胞的掺入破坏了交联的形成和网络的完整性，使得凝胶的流动性增强，这一点也可以通过流变学观察到。在低藻酸盐浓度下，离子网络的部分破坏降低了屈服应力并提高了喷雾性能；但较高量的聚合物会在邻近链之间形成密集的交联结构，产生一种刚性较高的凝胶，这种凝胶更倾向于挤出而非雾化（图S11）。虽然藻酸盐葡醛酸块之间的离子螯合对于凝胶化至关重要，但凝胶的整体刚性主要由坚硬的多糖骨架决定，这限制了链的灵活性并增强了机械强度。预组织的半刚性链结构限制了链的运动，从而增强了交联所提供的结构加固效果。

扫描电子显微镜用于研究喷雾输送如何影响PA超分子水凝胶的形态和孔隙率。与离子交联对照组相比，喷雾后的水凝胶具有更薄的支架特征和减少的条带结构，这与剪切引起的离子交联破坏一致。动态的超分子骨架使得网络在喷雾过程中能够在高剪切力下变形，然后在流动停止后迅速恢复，重新建立水凝胶结构。尽管存在这些短暂的分解，每个样品仍然保留了适合细胞迁移的支架状特征和相互连接的孔隙，展示了PA超分子聚合物水凝胶作为可喷雾组织支架的潜力（图4f,g）。即使在高细胞负载水平下，PA超分子聚合物水凝胶也能保持其凝胶结构和机械完整性，这反映了其动态非共价网络的特性。为了展示其实际应用性，该水凝胶通过皮下注射和局部喷雾方式输送到鸡的鸡腿中（图5a,b）。注射后，材料定位准确；而喷雾后的水凝胶则附着在组织表面，能够抵抗机械搅拌和水的浸泡（支持信息，视频S1和S2）。

通过三步振荡协议量化了PA水凝胶的触变恢复过程。在LVR（低剪切范围）内施加低应变，然后在与LVR相比的高应变下进行较长时间的处理以引起显著变形，随后再恢复到低应变。无论是在无细胞、低细胞负载还是高细胞负载的情况下，水凝胶都能完全恢复，能够承受高达400%的应变而不影响其机械性能（图5c–e）。相比之下，高基质浓度的藻酸盐虽然表现出触变和剪切稀释行为（图S12），但由于刚性交联和共价骨架的存在，难以抵抗喷雾过程中遇到的极高剪切力，导致喷嘴堵塞和液滴破碎不完全（支持信息，视频S3）。这种对比突显了PA超分子水凝胶如何独特地结合了高剪切韧性と喷雾可行性，使其适合于微创输送。

通过乳酸脱氢酶（LDH）释放的定量测量和活细胞共聚焦荧光显微镜来评估PA水凝胶的细胞相容性。由于细胞融合度的限制，初始细胞浓度较高时无法使用，因此无法直接使用与材料性能试验（DoE）中使用的细胞浓度相匹配的细胞浓度。进行了基于细胞的细胞相容性实验，以评估喷雾输送后静态水凝胶中的PA超分子聚合物水凝胶相关的细胞毒性（图6）。已知藻酸盐基系统的低细胞毒性，这与在PA系统中观察到的结果一致（38,92）。经过48小时的培养后，发现活细胞仍在PA超分子聚合物水凝胶中活跃迁移（图6a–c）。值得注意的是，所有测试的水凝胶浓度下都观察到了细胞迁移现象，且未观察到与聚合物浓度相关的显著细胞毒性（图6d）。细胞在不同焦点平面被检测到，表明它们能够通过水凝胶网络进行三维迁移，并在迁移后附着在培养皿表面，这与无水凝胶对照组类似（图S13a）。培养72小时后未观察到细胞毒性显著增加，进一步证明了PA超分子聚合物水凝胶的稳定性和细胞相容性（图S13b）。进一步研究了喷雾输送后的细胞存活情况，发现添加PA水凝胶对72小时培养期间的细胞存活率没有负面影响（图6e）。此外，PA超分子聚合物水凝胶的加入增强了喷砂后的细胞保留和粘附能力（图6f），因为喷入培养皿并翻转后的细胞仍留在培养皿内，表明其具有良好的基底粘附性，这对未来的组织再生应用具有相关性。这些结果共同证实了PA超分子水凝胶的高细胞相容性及其在高剪切输送后保持细胞存活和功能的能力。

最初计划了两个全因子设计，以了解PA超分子聚合物水凝胶与共价聚合物藻酸盐水凝胶在细胞加载方面的功能和局限性，采用质量-设计方法评估了含有不同聚合物和细胞填料水平的凝胶配方。我们试图理解这些参数对依赖响应变量（Y1–Y3）的相互作用和影响，这些变量影响细胞负载水凝胶的应用。填料和聚合物的水平是基于对共价和离子聚合物凝胶的类似研究确定的，我们预期会在某个程度达到最大细胞加载量，此时会观察到机械性能的显著损失。令人兴奋的是，我们范围内的任何细胞填料水平都与PA超分子聚合物水凝胶没有负面相互作用。主要效应图显示了聚合物浓度对机械性能的影响，但并未影响基于应用的响应变量。随着PA超分子聚合物浓度的增加，由于更大的缠结和分子内交联作用，可以实现更高的粘度和硬度（图7a–c）。进一步比较了DoE框架外的无细胞对照组，发现无论加入多少填料，水凝胶的性能都没有显著下降。相比之下，藻酸盐基水凝胶的机械性能随着填料含量的增加而显著降低。具体来说，向藻酸盐水凝胶中添加填料会导致粘度和硬度在所有评估的浓度下显著降低，性能下降的程度与藻酸盐浓度和细胞浓度有关（图7d–f）。这种机械性能的下降归因于藻酸盐网络的堆积和交联受到破坏。交互作用图进一步证实了这种变化依赖于细胞浓度（图S14）。

全因子设计的DoE响应结果显示：对于PA网络响应变量（a）喷雾性能、（b）粘附性和（c）硬度；对于共价藻酸盐网络响应变量（d）喷雾性能、（e）粘附性和（f）硬度，主要效应图得到了揭示。帕累托图显示了因素对响应变量的影响：（g）PA系统中的喷雾性能、（h）粘附性和（i）硬度；共价藻酸盐系统中的（j）喷雾性能、（k）粘附性和（l）硬度。统计分析使用Minitab统计软件进行，显著性设定为α = 0.05。标准化效应的统计分析显示，虽然细胞和超分子聚合物浓度分别独立影响硬度、面积覆盖率和粘附性，但它们的交互项始终低于显著性阈值（α = 0.05，图7）。这表明细胞和PA超分子聚合物水的组合效应在测量结果中既不产生协同效应也不产生拮抗效应。这些变量的解耦性质表明，细胞和基质的贡献可以独立调节材料和生物反应。此外，在标准效应图中，唯一具有显著性的PA超分子聚合物水凝胶响应是喷雾面积覆盖率。然而，这些因素都没有使喷雾面积覆盖率低于DoE框架外的对照喷雾，这可能是Spot-On基底或液滴聚结行为的结果（图7g–i）。相比之下，藻酸盐系统在刚度和粘附性响应变量上显著依赖于交互项，这突显了填料浓度增加对共价聚合物网络材料性能的破坏性影响（图7j–l）。

藻酸盐基聚合物显示出对细胞加载和聚合物浓度的放大响应和更高的敏感性，导致性能变化明显且系数确定性强。相比之下，PA超分子聚合物水凝胶的反应较为温和，R2值较低，反映了实验变异性占主导地位。这种差异突显了材料行为的本质差异：超分子组装的动态、可逆性使得建模变得复杂，而藻酸盐系统表现更为可预测，并且能够通过所选因素很好地捕捉其行为。因此，细胞负载和聚合物浓度显著解释了藻酸盐系统的变异性，但在同一设计空间内，对于PA超分子聚合物的影响较小。此外，尽管钙浓度保持恒定以限制DoE空间的维度，但聚合物含量的增加必然改变了两种水凝胶系统的有效交联密度，在解释不同配方之间的绝对模量时需要考虑这一因素。使用DoE方法使我们能够更好地理解整个设计空间以及细胞加载和聚合物浓度对最终材料性能的影响，其中超分子骨架的动态性质为更高的细胞掺入提供了可能性，同时保持了材料性能。

本研究为设计能够在注射或喷雾相关的高剪切力下成功输送细胞的PA超分子聚合物水凝胶提供了结构-功能框架。通过采用全因子DoE方法，我们阐明了聚合物浓度和细胞负载对水凝胶机械完整性、粘附性和喷雾性能的独立和综合影响。值得注意的是，即使在高细胞负载下，PA超分子聚合物水凝胶也保持了流变稳定性和结构完整性，这与藻酸盐基对照组形成鲜明对比，后者在相同的细胞负载下经历了显著的机械性能损失。PA超分子聚合物水凝胶的动态、非共价β-折叠片驱动的自组装，结合非共价离子交联，使其在剪切作用下具有内在的适应性，从而实现了可注射性和喷雾性，同时不牺牲性能。这些材料在受到高剪切力作用后能够迅速重组水凝胶结构，并牢固附着在软组织基底上；即使在反复受到机械扰动的情况下，也能恢复原有的结构。这些特性使它们成为下一代微创再生疗法的理想候选材料。流变学和黏附性分析表明，细胞的掺入对材料的机械强度或与基底的结合性能影响极小；扫描电子显微镜（SEM）观察结果进一步证实，这些材料在发生形变后能够快速重构其网络结构，这与天然细胞外基质（ECM）的特性高度相似。相比之下，离子交联的藻酸盐由于刚性连接区域的破坏，会表现出模量下降和剪切敏感性增加的现象。这些研究结果揭示了一个可推广的设计原则：可逆的超分子交联技术能够制造出可喷涂的、负载有细胞的支架，同时保持材料的结构和功能性，为微创组织工程应用提供了坚实的基础。这项研究强调了超分子设计原则在克服高剪切力和微创输送条件下生物材料设计局限性方面的巨大潜力。