微滴胰蛋白酶消化：抗体快速结构表征与定量的新突破 中文标题：基于在线微滴胰蛋白酶消化的抗体快速结构表征与定量方法研究

《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Rapid Antibody Structural Characterization and Quantification via Microdroplet Trypsin Digestion

本文提出了一种利用在线微滴胰蛋白酶消化技术实现单克隆抗体快速表征与定量的新方法。该方法实现了超快消化（<1 ms）、高消化效率（>90%）及自动化操作，能够有效进行肽段图谱绘制，并精确定位和定量天冬酰胺脱酰胺化及甲硫氨酸氧化等关键翻译后修饰（PTM）。相较于传统溶液消化，该方法耗时极短，且能减少人工修饰产物，在抗体药物的质量分析与绝对定量方面展现出显著优势，为生物治疗行业提供了高通量、高准确性的分析新策略。

　　

引言

微滴作为一种独特的反应介质，相较于常规溶液相反应，能显著加快反应速率。先前的研究已报道了通过将治疗性单克隆抗体（mAbs）与胰蛋白酶等蛋白水解酶混合并喷雾，进行离线和在线微滴消化的方法，成功检测了带有不同糖型的抗原结合F(ab′)亚基和单链片段可结晶（scFc）亚基。本研究旨在开发一种超快在线微滴消化方法，用于抗体的快速表征与定量。

实验部分

试剂与样品制备

实验使用了NIST mAb参考标准品、轻链和稳定同位素标记的贝伐珠单抗（贝伐珠单抗）等抗体。对于还原烷基化的NIST mAb，首先用二硫苏糖醇（DTT）还原二硫键，再用碘乙酰胺（IAA）烷基化游离巯基，并通过分子量截留（MWCO）过滤器进行脱盐。对于快速还原，则使用三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）在60°C下孵育5分钟。

在线微滴消化

所有实验在Agilent 1290 Infinity II液相色谱仪与Agilent 6545XT Q/TOF质谱仪联用系统上进行。抗体和测序级胰蛋白酶储存于液相自动进样器中，通过注射程序连续吸取、在进样环中混合，并以5 mM碳酸氢铵（ABC）缓冲液为流动相，在100 μL/min流速下进行2分钟的流动注射（FI），进入Agilent Jet Stream（AJS）离子源产生微滴。每次注射吸取0.2 μL NIST mAbs和0.2 μL胰蛋白酶，使微滴消化中的蛋白质与酶的比例为10:1。采用迭代串联质谱（MS/MS）来增强数据采集深度和蛋白质序列覆盖率。

消化效率比较

通过标准加入法评估微滴消化与传统溶液消化的效率。将不同浓度的标准肽DTLMISR分别掺入经过微滴消化或溶液消化的还原NIST mAb样品中，生成标准加入曲线。结果表明，微滴消化与溶液消化具有相近的消化效率。

过氧化氢应激NIST mAb的样品制备与定量

用0.1%（v/v）过氧化氢（H₂O₂）在室温下涡旋孵育NIST mAb不同时间（0、1、2、3小时）以诱导氧化。应激后的样品用TCEP还原，然后通过在线微滴消化结合靶向MS/MS监测DTLMISR及其氧化形式DTLM(O)ISR进行氧化水平评估。

脱酰胺化NIST mAb的样品制备

将NIST mAb在1 M pH 8的Tris缓冲液或去离子水中于40°C下孵育5至7天以引入人工脱酰胺化。孵育后，用TCEP还原抗体，并通过靶向MS/MS在微滴消化过程中监测不同天冬酰胺（Asn）含量肽段的脱酰胺化水平。

基于微滴消化的抗体绝对定量

对于抗体绝对定量，将轻链贝伐珠单抗与不同量的重链稳定同位素标记的贝伐珠单抗混合制备校准混合物。使用10 mM ABC作为流动相，以20 μL/min的流速在线进行贝伐珠单抗的微滴消化，并通过靶向MS/MS监测特征肽段（如ALPAPIEK）的重链与轻链离子强度比，建立校准曲线。

仪器

使用AJS离子源，设置特定的干燥气流量、鞘气温度、雾化器压力等参数。质谱采集范围及碰撞能量（CE）根据肽段电荷数进行优化。迭代MS/MS参数针对微滴消化的复杂性进行了优化，以增加肽段鉴定深度。

结果与讨论

还原NIST抗体的微滴消化

在线微滴消化的通用工作流程包括抗体的还原烷基化、脱盐，然后与胰蛋白酶在线混合、雾化成微滴并立即进行质谱检测。三次迭代MS/MS分析增加了鉴定深度。如图1所示，未添加胰蛋白酶时，还原抗体在质谱图中显示出轻链（LC）和重链（HC）的强离子信号；当共注射胰蛋白酶进行在线微滴消化后，胰蛋白酶肽段出现在m/z 300–1300区域，同时轻链和重链信号大幅下降，消化效率分别达到约90%和99%。通过三次迭代MS/MS，获得了53%的序列覆盖率，结合MS1鉴定，整体序列覆盖率达到91%。

通过标准加入法进一步评估消化效率，结果表明微滴消化产生的目标肽DTLMISR浓度略低于溶液消化，具有相近的消化效率，但可能由于脱盐过程中的样品损失或不完全消化，产率相对较低。

NIST mAb脱酰胺化水平的监测

脱酰胺化是抗体的关键翻译后修饰（PTM），会影响药物的稳定性、药代动力学和效能。本研究成功通过在线微滴消化和靶向MS/MS监测了NIST mAb中多个天冬酰胺含量肽段的脱酰胺化。重点关注了肽段GFYPSDIAVEWESN³⁸⁷GQPEN³⁹²N³⁹³YK。通过分析其y₆和y₁₀碎片离子的同位素峰分布变化，发现脱酰胺化主要发生在N³⁸⁷位点（位于NG基序），而非N³⁹²或N³⁹³位点（位于NN基序）。计算表明，在pH 8的Tris缓冲液中孵育5天后，N³⁸⁷位点的脱酰胺化程度约为32%，而在去离子水中约为10%。这一结果与先前关于天冬酰胺脱酰胺化倾向的研究一致，即天冬氨酸位于甘氨酸（G）旁时更容易发生脱酰胺。

研究还监测了其他天冬酰胺肽段（如TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN²⁷⁹WYVDGVEVHN²⁸⁹AK）的脱酰胺化，发现主要脱酰胺化位点是N²⁸⁹（位于NA基序），而非N²⁷⁹（位于NW基序），这同样与残基大小的影响相符。

甲硫氨酸氧化的定量

甲硫氨酸氧化是抗体另一个重要的质量属性（CQA）。本研究通过在线微滴消化实现了对抗体氧化水平的准确定量。首先比较了微滴消化与溶液消化的相对氧化水平，发现微滴消化测得的氧化水平（4.7%）略低于溶液消化（6.1%），表明更长的溶液消化过程可能引入了额外的氧化。更重要的是，研究发现氧化肽段DTLM(O)ISR与非氧化肽段DTLMISR的电离效率存在显著差异（氧化肽的电离效率高出约4.6倍），这会导致基于离子强度直接比较的相对定量结果出现偏差。

为了获得准确结果，采用标准加入法进行绝对定量。将已知浓度的合成氧化或非氧化标准肽掺入样品，建立标准曲线。对于经过1小时氧化应激的NIST mAb，计算得出肽段DTLMISR的氧化水平约为22%；而对于未应激样品，氧化水平仅为约1.2%。这证实了绝对定量方法在克服电离效率差异、获得准确氧化水平方面的优势。

抗体的绝对定量

本研究展示了通过在线微滴消化结合稳定同位素标记内标进行抗体绝对定量的可行性。将目标轻链贝伐珠单抗与重链稳定同位素标记的贝伐珠单抗以不同比例混合，进行在线微滴消化。选取特征肽段ALPAPIEK，通过靶向MS/MS监测其轻链与重链y₄碎片离子的强度比，并建立校准曲线。该曲线展现出优异的线性（R²= 0.99），方法检测限（LOD）为1.2 ng，定量限（LOQ）为4.1 ng。根据校准曲线计算出的目标抗体量与理论注射量相差仅0.6%，证明了该方法的高准确性。

使用另一个肽段TPEVTCVVVDVSHEDPEVK也进行了类似的定量，结果同样显示出良好的线性与合理的准确度（10.0%的定量误差）。

结论

本研究成功展示了一种利用在线微滴胰蛋白酶消化结合MS/MS分析的超快、自动化抗体表征与定量方法。该方法实现了毫秒级消化和约2.5分钟/样的进样周期，获得了高序列覆盖率，并能灵敏检测并准确定量天冬酰胺脱酰胺化（通过MS/MS碎片离子进行相对定量）和甲硫氨酸氧化（通过标准加入法进行绝对定量）等关键翻译后修饰（PTM）。此外，通过掺入同位素标记的标准抗体，该方法还能实现抗体的绝对定量。与传统溶液消化相比，该方法在样品制备过程中引入的脱酰胺化和氧化等人工修饰更少，为肽段图谱绘制和抗体定量提供了一种快速、可靠的新方法，在生物治疗行业中具有重要的应用价值。