《Molecular Horticulture》：RsWRKY15–RsPDR12 module regulates Cd uptake and accumulation by promoting Cd efflux in radish (Raphanus sativus L.)
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本研究揭示了萝卜中一个关键的WRKY15–PDR12调控模块。在镉（Cd）胁迫下，转录因子RsWRKY15被激活，它结合到多效耐药蛋白基因RsPDR12的启动子上，激活其转录。RsPDR12蛋白定位于质膜，在酵母、拟南芥和萝卜中均证实其具有Cd2+转运活性，能够通过促进Cd2+从根部细胞外排来降低植物体内的Cd积累，并缓解Cd胁迫引起的氧化损伤。这项工作不仅阐明了萝卜肉质根中Cd积累的分子调控新机制，也为萝卜等根菜类作物的低镉品种（low Cd-accumulation cultivars）选育提供了重要的遗传改良靶点和理论支持。
研究背景与意义
镉（Cd）是一种非必需且具有毒性的重金属，由于半衰期长且不可生物降解，已成为严重的环境污染物。它能在植物组织中积累，通过食物链威胁人类健康。萝卜（Raphanus sativus L.）作为一种重要的根菜类作物，其可食用的肉质根（taproot）是Cd积累的主要部位，严重影响其安全生产和品质。因此，深入理解萝卜响应Cd胁迫、调控Cd吸收与积累的分子机制，对于培育低镉积累品种、保障农产品安全具有重要的理论和应用价值。多效耐药（Pleiotropic Drug Resistance， PDR）蛋白属于ATP结合盒（ATP-binding cassette， ABC）转运蛋白G亚家族（ABCG），在植物响应重金属胁迫中扮演关键角色。然而，PDR基因在萝卜中调控Cd积累的机制尚不明确。
RsPDR12基因在镉胁迫下的表达特征与功能验证
本研究首先对RsPDR12基因在Cd胁迫下的表达模式进行了分析。RT-qPCR结果显示，在0.1 mM CdCl2处理下，萝卜根中RsPDR12的表达量显著上调，并在处理24小时后达到峰值。亚细胞定位实验表明，RsPDR12-GFP融合蛋白定位在质膜上，这与其作为转运蛋白的功能相符。启动子活性分析（GUS和LUC报告系统）进一步证实，Cd胁迫能显著激活RsPDR12启动子的活性。
为了验证RsPDR12的Cd转运功能，研究者在酵母细胞中进行了功能互补实验。在诱导表达条件下，携带RsPDR12的酵母细胞在含Cd培养基上生长优于空载体对照组，并且其细胞内的Cd含量显著降低，这直接证明了RsPDR12具有Cd转运活性，并能减少酵母细胞对Cd的积累。
随后，研究者构建了RsPDR12过表达（OE）的拟南芥株系。在Cd胁迫下，与野生型（WT）相比，RsPDR12-OE株系表现出更长的根长、更高的鲜重以及更低的根中Cd含量。双硫腙染色和Cd荧光探针检测均显示OE株系根部Cd沉淀和荧光信号更弱。更重要的是，利用非损伤微测技术（NMT）对根部伸长区Cd2+流进行实时监测发现，RsPDR12-OE株系根部表现出Cd2+外排（正值），而WT则表现为Cd2+内流（负值）。这些结果清晰地表明，RsPDR12过表达通过促进Cd2+从根部细胞外排，从而降低了植物对Cd的吸收和积累。
在萝卜中瞬时过表达或沉默RsPDR12也证实了其功能。Cd胁迫下，过表达株系的子叶中过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2-）和丙二醛（MDA）含量降低，而脯氨酸含量升高，同时DAB和NBT染色显示活性氧（ROS）积累减少。反之，沉默株系表现出相反的效应。这说明RsPDR12通过减少Cd积累，有效缓解了Cd胁迫引起的氧化损伤和膜脂过氧化。
上游转录因子RsWRKY15的鉴定与功能
为解析RsPDR12的上游调控机制，研究者利用酵母单杂交（Y1H）文库筛选技术，从萝卜cDNA文库中筛选到能与RsPDR12启动子结合的转录因子RsWRKY15。进一步的Y1H实验证实，RsWRKY15特异性地结合在RsPDR12启动子区含有W-box（核心序列GAGTCACA）的S2片段上，当W-box核心序列发生突变时，结合作用消失。双荧光素酶报告基因（DLA）实验进一步证明，共表达35S::RsWRKY15和pRsPDR12::LUC能显著增强LUC信号和活性，表明RsWRKY15能够激活RsPDR12的转录。
对RsWRKY15本身的研究发现，其表达在Cd胁迫下同样被显著诱导，并在24小时达到最高。亚细胞定位显示RsWRKY15定位于细胞核。其启动子活性在Cd处理下也显著增强。
功能研究表明，在烟草（Nicotiana benthamiana）中过表达RsWRKY15，能增强植株在Cd胁迫下的生长活力，降低根中Cd含量。NMT分析显示，OE株系根部Cd2+内流显著低于WT。此外，在烟草OE株系中，内源NtPDR12的表达量也显著上调。在萝卜中的瞬时转化实验得到了类似结果：RsWRKY15过表达降低了子叶中的Cd含量、ROS积累和膜脂过氧化程度，同时脯氨酸含量升高，并且RsPDR12的表达量随之增加。这些结果综合表明，RsWRKY15通过正向调控下游靶基因RsPDR12的表达，来减少Cd的积累并增强植物的Cd耐受性。
RsWRKY15–RsPDR12调控模块的模型与意义
基于上述发现，研究者提出了一个萝卜肉质根中Cd积累的调控模型。当萝卜根系遭受Cd胁迫时，上游转录因子RsWRKY15被激活，其表达量和启动子活性升高。活化的RsWRKY15蛋白进入细胞核，直接结合到RsPDR12基因启动子的特定W-box元件上，从而激活RsPDR12的转录。大量合成的RsPDR12蛋白定位在根细胞的质膜上，发挥Cd2+外排泵的功能，将细胞内的Cd2+主动转运到细胞外，有效降低了根细胞对Cd的吸收和积累。细胞内Cd浓度的降低，进而减轻了Cd引发的氧化应激（ROS爆发）和膜脂过氧化等毒害作用，最终提升了萝卜植株对Cd胁迫的整体耐受性。
这项研究首次在萝卜中鉴定并功能解析了WRKY15–PDR12这一重要的转录调控模块，系统阐明了其通过促进Cd外排来减少Cd积累的分子机制。该发现不仅深化了我们对植物尤其是根菜类作物响应重金属胁迫分子网络的理解，更重要的是，为利用分子育种技术（如基因编辑或转基因）定向改良萝卜品种，培育低镉积累、安全生产的萝卜新品种提供了关键的理论依据和珍贵的基因资源。
