《Molecular Horticulture》：Genome-wide reprogramming of sRNA and lncRNA in the epigenetic regulation following interspecific hybridization in the Brassica species
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这篇综述系统阐述了芸薹属物种间杂交后，非编码RNA（ncRNA）与表观遗传调控网络的深度互作。文章揭示了sRNA（尤其是24-nt siRNA）和lncRNA如何在DNA甲基化与染色质可及性（ACR）的动态变化中发挥核心作用，调控基因表达，从而影响杂交优势（heterosis）与基因组稳定性，为理解植物进化与育种提供了新视角。
种间杂交后sRNA表达水平的快速变化
杂交过程会激活转座子，破坏小RNA的稳定性并改变基因表达。本研究通过将甘蓝型油菜的两个近交系作为母本，与白菜作为父本进行杂交，产生了两种异源三倍体杂交种（Hybrid-sh 和 Hybrid-yh）。对它们及其亲本进行sRNA测序分析发现，sRNA在基因组中的分布与基因密度呈正相关。在A亚基因组中，F1杂交种的sRNA密度高于母本但低于父本，而在C亚基因组中则低于母本。这表明基因组重组介导的sRNA动态表达可能调控转录的激活或抑制。通过计算模拟杂交种与真实F1杂交种的比较发现，杂交对sRNA的调控具有基因型依赖性，并且长度特异的sRNA（如21-nt和24-nt）表达模式在杂交种中发生了显著改变。
F1杂交种及其亲本系中不同长度的siRNA位点
我们进一步分析了F1杂交种及其亲本系中siRNA簇的密度。在所有类别中，21-nt和24-nt siRNA簇都比其他长度的簇更富集。研究表明，24-nt siRNA能够指导DNA甲基化酶作用于转座子区域，导致甲基化，从而抑制转录并稳定基因组。分析发现，大约60%的24-nt siRNA簇源自转座子。与亲本相比，F1杂交种的24-nt siRNA簇密度在基因体附近呈现母本 > 杂交种 > 父本的趋势，而在与转座子相关的区域则无显著差异，这表明24-nt siRNA在杂交种中的积累动态优先影响基因区域而非转座子区域。
全基因组范围内不同长度miRNA和phasiRNA的分布
在植物中，小RNA的长度在20至25个核苷酸之间。我们总共鉴定出343个miRNA和5,678个phasiRNA。其中，21-nt miRNA最为普遍，占72.6%。对于21-nt和24-nt的phasiRNA，大部分富集在启动子区域。与亲本相比，我们在Hybrid-sh和Hybrid-yh中分别鉴定出95个和266个被激活的phasiRNA，以及156个和235个被沉默的phasiRNA，这表明Hybrid-yh更容易因种间杂交而发生基因组重排。大多数被激活的phasiRNA位于启动子区和远端区。
F1杂交种中差异表达的miRNA和phasiRNA
杂交种中miRNA和siRNA表达的改变可调控靶基因，确保基因组稳定性并影响植物生长。与亲本相比，F1杂交种中共有318个差异表达miRNA和647个差异表达phasiRNA。例如，靶向ATHB14和ATHB4等基因的miR166在Hybrid-sh中的表达相对于两个亲本均升高，而靶向GAMYB2等基因的miR159在杂交种中的表达水平则低于亲本。值得注意的是，miR166、miR171和miR159家族在F1杂交种的sRNA读数中占主导地位。
AS-lncRNA和lincRNA在芸薹属异源三倍体杂交种中被重新编程
我们通过链特异性RNA测序评估了种间杂交诱导的lncRNA激活。共注释了47,855个lncRNA，主要分为基因间lncRNA和反义lncRNA。两个F1杂交种中仅28.3%的lncRNA是组成型表达的。与mRNA相比，lncRNA在母本系和F1杂交种中都表现出更高比例的差异表达，突显了lncRNA在种间转录分歧中的重要作用。通过模拟杂交种分析发现，lncRNA的表达在种间杂交过程中比mRNA更易受到影响。此外，siRNA在lincRNA及其上下游区域的积累显著高于AS-lncRNA，这表明lincRNA更容易成为siRNA的靶标。
mRNA和ncRNA的加性和非加性表达模式
在多倍体形成后，基因表达会从剧烈的不稳定转变为逐渐稳定。我们将F1杂交种中mRNA和ncRNA的表达模式分为加性和非加性。mRNA在两个杂交种中都表现出一致的加性表达，而ncRNA则显示出基因型特异性的加性效应。在Hybrid-sh中，偏向母本的表达水平优势（ELD-M）的mRNA和ncRNA水平始终高于Hybrid-yh。此外，大多数在Hybrid-yh中超越亲本表达（transgressive regulation）的mRNA和非编码RNA数量都多于Hybrid-sh。这些差异表明了亲本基因组之间存在特定的相互作用。我们还分析了顺式和反式调控的影响，发现超越性上调的lncRNA与基因表达呈更强的正相关，而phasiRNA对基因表达的顺式效应较弱。对于反式效应，负相关的miRNA-mRNA对数量超过正相关对，总体相关性为负。对ELD-M miRNA靶基因的GO富集分析显示，它们涉及对刺激的响应、器官发育以及赤霉素和脱落酸途径。
ncRNA介导的DNA甲基化对F1杂交种邻近基因表达的影响较小
种间杂交驱动了与ncRNA表达变化紧密相关的DNA甲基化动态。我们对所有样本进行了全基因组亚硫酸氢盐测序，并量化了基因、转座子、siRNA簇和lncRNA的甲基化水平。在所有元件中，24-nt siRNA簇的CHG和CHH甲基化水平最高，而AS-lncRNA则最低。lincRNA在所有序列背景下的甲基化水平均高于AS-lncRNA。此外，与21/22-nt siRNA簇相邻的基因表达水平最高，而与24-nt siRNA簇、lincRNA或AS-lncRNA相邻的基因表达则无显著差异，这表明相邻序列的甲基化变异可能不直接驱动基因的差异表达。
24-nt siRNA簇直接影响F1杂交种的DNA甲基化水平
24-nt siRNA指导DNA甲基化酶作用于转座子区域，诱导序列特异性甲基化。与母本相比，F1杂交种表现出更多上调而非下调的24-nt siRNA簇。F1杂交种在上调的24-nt siRNA簇处显示出比亲本更高的DNA甲基化水平，而在下调的簇处甲基化水平降低，这直接将24-nt siRNA的动态变化与甲基化改变联系起来。与父本相比，参与RNA指导的DNA甲基化途径的基因BnaA06.DCL3在F1杂交种中显著下调。之前我们在甘蓝型油菜中构建了Bnadcl3基因编辑突变体，与野生型相比，其24-nt siRNA簇急剧减少，而21-nt簇增加，同时基因侧翼区域、基因体和转座子的DNA甲基化水平也降低，这证实了DCL3在甘蓝型油菜甲基化调控中的作用。进一步分析发现，与不含24-nt siRNA簇的转座子相比，含有该簇的转座子在CHG和CHH序列背景下的甲基化水平显著升高。在C亚基因组中，转座子的甲基化水平显著高于A亚基因组，这表明24-nt siRNA介导的RdDM途径可能增强了C亚基因组的稳定性。
ACR-lncRNA在种间杂交过程中调控基因表达
lncRNA通过与开放染色质相互作用来调控基因表达。我们利用ATAC-seq数据分析了基因、转座子和lncRNA的可及染色质区域分布。与mRNA相比，lncRNA在基因体内的ACR信号更强，这表明lncRNA可能在种间杂交过程中通过染色质可及性促进顺式调控。我们鉴定出数千个ACR相关的lncRNA，与非ACR-lncRNA相比，它们具有更高的表达水平和更长的转录本。此外，ACR-lncRNA邻近基因的表达水平也更高，其中41.2%的ACR-lncRNA与邻近基因呈正相关，证实了其顺式调控作用。值得注意的是，亲本和F1杂交种中分别有24.8%和24.2%的ACR-lncRNA是染色质富集的，同时有大量新的ACR-lncRNA在杂交种中出现，这突显了亲本与杂交种之间不同的调控格局。通过软聚类分析，ACR-lncRNA被分为六个簇，其中一些簇代表表达水平优势，而另一些则代表超越亲本的表达。例如，簇6中的ACR-lncRNA邻近基因涉及糖基化、类胡萝卜素代谢和钙信号传导等过程，这表明杂交驱动的代谢重新编程。
ACR相关的反义lncRNA lncRNA0410通过正向调控BnaA03.MYB12表达增强植物抗旱性
一个由ACR介导的反义lncRNA——lncRNA0410，与BnaA03.MYB12基因相关，它源自CP12-1基因的5′端区域。该反义lncRNA在Hybrid-yh的可及染色质区域中被检测到，但在Hybrid-sh中缺失。相应地，BnaA03.MYB12在Hybrid-sh中的表达水平显著低于Hybrid-yh。序列比对和系统进化树分析表明，lncRNA0410在十字花科内是保守的，并与多倍化进化相关。通过共表达分析和荧光素酶报告基因实验，证实了lncRNA0410能正向调控BnaA03.MYB12的表达。在杂交种中，BnaA03.MYB12及其下游基因BnaA10.FLS和BnaC09.FLS的转录水平，以及黄酮醇荧光信号和FLS酶活性，在Hybrid-sh中均低于Hybrid-yh。在模拟干旱胁迫下，Hybrid-yh的幼苗存活率也显著高于Hybrid-sh。为了进一步验证功能，我们构建了lncRNA0410过表达的甘蓝型油菜转基因株系。与野生型相比，过表达株系中BnaA03.MYB12表达上调，黄酮醇积累和FLS酶活性增强，并且在干旱胁迫下表现出更高的存活率。这表明lncRNA0410通过正向调控BnaA03.MYB12的表达来增强植物的抗旱性。
剂量依赖性lncRNA受到siRNA和DNA甲基化的协同影响
基因剂量平衡对于正常发育和表型稳定性至关重要。通过关联lncRNA和mRNA的表达与A/C亚基因组剂量的关系，我们鉴定出大量的剂量依赖性lncRNA。值得注意的是，13.1%的剂量依赖性lncRNA与剂量变化呈负相关，比例大约是剂量依赖性mRNA的2.5倍，这证实了lncRNA对剂量变化具有更高的敏感性。在Hybrid-yh和Hybrid-sh中，分别有约56%-72%的lincRNA和AS-lncRNA被归类为剂量依赖性，这表明显型特异的剂量响应不依赖于lncRNA的类型。我们还分析了调控lncRNA表达的siRNA、DNA甲基化和ACR。研究发现，siRNA在lncRNA上游2 kb区域富集，且剂量依赖性lncRNA体内的siRNA富集程度显著高于剂量非依赖性lncRNA。同时，剂量依赖性lncRNA在上游和下游2 kb位置的DNA甲基化水平也显著更高。此外，在lncRNA上下游2 kb区域也检测到ACR的富集，且剂量依赖性lncRNA的染色质开放程度大于剂量非依赖性lncRNA。这些机制——启动子靶向的siRNA/DNA甲基化和染色质开放——共同作用，调控着lncRNA的剂量敏感性，突显了它们在杂交基因表达网络中的重要作用。
