《Molecular Horticulture》：Multi-omics analysis of somatic mutants reveals TCP7 allelically regulates multiple carotenogenic genes in citrus
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本研究通过基因组(genome)、转录组(transcriptome)、DNA甲基化组(methylome)和染色质可及性(chromatin accessibility)多组学分析，结合全基因组关联研究(GWAS)，系统性揭示了体细胞突变影响柑橘果实颜色的分子调控网络。研究发现，TCP (TEOSINTE BRANCHED 1/CYCLOIDEA/PCF) 家族转录因子是调控果实颜色的核心因子，特别是CgTCP7，其不同等位基因（CgTCP7T和CgTCP7C）对类胡萝卜素合成基因（ZDS、BCH、NCED2）的差异调控，是决定柑橘果肉颜色多样性的关键机制，为园艺作物性状改良提供了重要的基因资源和育种靶点。
红肉与橙肉突变体起源于野生型柚子的独立体细胞突变事件
野生型关西蜜柚果肉为白色，而红肉和橙肉品种分别于2006年和2013年从中通过体细胞突变选育而来，表明至少发生了两次独立的体细胞突变事件。对三个材料在不同发育阶段果肉中主要类胡萝卜素（番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素和紫黄质）含量的测定发现，野生型在整个测试阶段总类胡萝卜素含量极低。红肉突变体中番茄红素含量从受精后120天开始显著增加并维持到成熟；而橙肉突变体的β-胡萝卜素含量早在幼果期（60天）就处于高水平。成熟红肉果实的汁胞中积累了丰富的番茄红素，而橙肉果实则积累了高水平的β-胡萝卜素，这可能是二者果肉颜色差异的原因。在关键的转色期，通过RT-qPCR评估类胡萝卜素合成基因的表达水平，发现与野生型相比，ZETA-CAROTENE DESATURASE (ZDS)、BETA CAROTENOID HYDROXYLASE (BCH)和NINE-CIS-EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE 2 (NCED2)在红肉和橙肉果实中均显著上调。此外，整个类胡萝卜素生物合成通路的活性评分也显著增加。
构建泛基因组未发现颜色突变体中类胡萝卜素基因的功能性变异
为了检测是否存在导致果肉颜色变化的DNA变异，研究团队结合Illumina短读长、HiFi长读长和高分辨率染色体构象捕获(Hi-C)测序数据，通过迭代组装策略构建了高质量染色体级别的关西蜜柚泛基因组。利用长读长数据和深度学习技术识别突变体相对于野生型的遗传变异，发现大部分变异为点突变，且多位于非编码区或不改变蛋白质序列。对于类胡萝卜素生物合成的关键基因，未发现可能导致其结构或功能改变的基因序列或其上游2kb区域的变化，排除了这些基因本身的突变是造成两种突变体果肉颜色变化的机制基础。
转录调控组学分析揭示颜色突变体中类胡萝卜素高积累是为了清除过量氧化物质
通过对转色期果肉进行ATAC-seq以量化染色质可及性，发现在全基因组尺度上，突变体与野生型的染色质可及性模式几乎相同。约65%的开放染色质区域位于转录起始位点上游3kb内，其中上游1kb区域的可及性程度和频率最高。基于RNA-seq分析鉴定差异表达基因，基因本体(GO)富集分析表明，在红肉和橙肉突变体中均显著上调的基因显著富集在与氧化还原酶活性、电子载体活性和血红素结合相关的类别。对于橙肉突变体，上调基因还富集在与转运蛋白活性和营养储存活性相关的类别。结合类胡萝卜素在突变体中大量积累的现象，这些结果表明颜色突变体可能合成并积累类胡萝卜素以清除过量的氧化物质，导致其果肉呈现红色或橙色。
鉴定出TCP是果实颜色性状背后的核心调控转录因子
为鉴定导致果肉颜色差异的核心调控转录因子，研究设计了一种利用ATAC-seq数据的方法。一个核心调控转录因子应满足两个条件：其结合位点在突变体与野生型相比的差异开放区域中显著富集；同时在突变体与野生型之间表现出差异结合的“足迹”模式。通过结合差异开放染色质区域的转录因子结合位点富集分析和足迹模式分析，发现只有TCP转录因子的结合基序在突变体中显著富集，并且其足迹模式在突变体和野生型之间存在差异，而其他类型的转录因子未显示差异足迹模式。这表明TCP型转录因子很可能是影响果肉颜色的核心调控转录因子。结合同源性分析和系统发育关系分析，筛选出在果肉中高表达的四个候选TCP转录因子基因：CgTCP3、CgTCP7、CgTCP10和CgTCP20。
TCPs在转录水平上调控多个类胡萝卜素生物合成基因
类胡萝卜素合成基因ZDS、BCH和NCED2的启动子被预测含有TCP结合位点，且它们的表达水平在野生型和颜色突变体之间存在差异。电泳迁移率变动分析(EMSA)证实，CgTCP3、CgTCP7（存在T和C两种等位基因型）和CgTCP20与这些基因的启动子探针存在强烈的物理相互作用。CgTCP7是在红肉和橙肉突变体染色质可及性分析中均被鉴定出的唯一核心转录因子。双荧光素酶报告基因实验表明，CgTCP7可以抑制BCH和NCED2启动子的转录活性，同时激活ZDS的转录。
正向选择的CgTCP7等位基因对柑橘类胡萝卜素积累的贡献
对663份柑橘种质资源的基因组序列进行分析发现，TCP7在不同柑橘种中高度保守。但在柚子群体中，CgTCP7区域的遗传多样性显著高于其他柑橘群体。特别值得注意的是，仅在柚子及其后代（部分酸橙品种）中存在TCP7T单倍型，而所有其他柑橘物种均为TCP7C纯合子。遗传多样性显著降低和等位基因频率的偏斜表明，TCP7在柚子中经历了强烈的正向选择，其中TCP7T单倍型是柚子特有的单倍型。对柚子群体果肉类胡萝卜素组成的全基因组关联分析(GWAS)揭示了控制果肉颜色的多个主要基因组区域，其中CgTCP7的物理位置与7号染色体上的一个显著关联区域重叠。CgTCP7等位基因与柚子果肉中类胡萝卜素的存在与否显著相关，TCP7T在67%的无色柚子种质中出现。进一步的实验证实，CgTCP7C比CgTCP7T对NCED2和BCH转录的抑制作用更强，而CgTCP7T比CgTCP7C对ZDS转录的激活作用更强。CgTCP7等位基因对类胡萝卜素合成基因的差异调控，很可能导致了柚子和其他柑橘果实的颜色差异。
总结
研究通过对野生型柚子及其两个不同果肉颜色的体细胞突变体进行基因组、转录组、DNA甲基化组和染色质可及性多组学分析，鉴定出三个核心TCP转录因子（CgTCP3、CgTCP7和CgTCP20），它们通过调控多个关键类胡萝卜素生物合成基因的表达，影响类胡萝卜素的组成和含量。其中，CgTCP7在柚子种质中经历了正向选择，其不同等位基因（CgTCP7T和CgTCP7C）对类胡萝卜素基因的表达和类胡萝卜素的积累具有差异调节作用。这项研究不仅揭示了体细胞突变形成颜色性状的分子调控机制，也为利用体细胞突变和天然等位基因变异进行园艺作物品质改良育种提供了重要的理论基础和基因资源。
