RNA m6A去甲基化酶FTO的过表达能够提高生菜中天然橡胶的产量

《Molecular Horticulture》：Overexpression of RNA m6A demethylase FTO enhances the yield of natural rubber in lettuce

天然橡胶（NR）产量提升机制研究中，过量表达FTO基因显著增加结球生菜乳管细胞数量和天然橡胶合成相关代谢物（如acetyl-CoA和IPP），并通过m?A去甲基化调控糖代谢和次生代谢通路。

　　

天然橡胶（NR）因其广泛的工业应用而在各种商业活动中得到广泛使用。尽管有超过2500种植物能够产生NR，但其主要商业来源仍然是橡胶树Hevea brasiliensis（Mooibroek和Cornish 2000）。最近，一些具有商业潜力的产胶植物，如生菜和俄罗斯蒲公英Taraxacum kok-saghyz，引起了研究人员的兴趣（Cao等人2025；Cherian等人2019）。FTO作为一种保守的去甲基化酶，参与了糖酵解代谢（Wang等人2023）、糖异生（Peng等人2019）以及细胞发育和分化（Deng等人2021）。在多种作物中过表达FTO可以提高产量（Yu等人2021），但m⁶A修饰是否影响产胶植物的橡胶生物合成尚不清楚。

在这项研究中，我们构建了一个FTO过表达载体（图S1A），并将其转入生菜（Ninja）中进行表型观察。通过对FTO转基因T0代植物的拷贝数分析，选出了单拷贝转基因株系，以便在T2代进行后续表型评估（图S1B）。针刺试验表明，FTO-OE株系的茎（图S1C）和叶（图S1D）中分泌的乳胶更多，且FTO-OE株系的叶绿素含量（图S1E）和茎粗度（图S1F）显著增加。我们证明，在生菜中过表达RNA去甲基化酶FTO（图1A-C）可使乳胶产量增加6.89%至14.21%（图1D, E）。为了确定FTO-OE植物中的乳管细胞是否发生变化，我们使用了碘-溴溶液和苏丹黑B染色技术对茎、根和叶进行了染色（Castelblanque等人2018；Chao等人2023；Zhang等人2015）。结果显示，用碘-溴染色的根（图1F, H）和茎（图1G, I）中乳管细胞的相对面积显著增加。此外，苏丹黑B染色显示OE-19株系的乳管细胞染色更明显（图S1G）。进一步的研究表明，通过高效液相色谱-凝胶渗透柱（HPLC-GPC）分析，所有OE株系的分子量（图1J）和PDI（图S1H）没有变化（图S1I）。使用1,4-二氧环烷作为标准物，通过核磁共振（NMR）定量测定了转基因株系干乳胶中的橡胶烃含量。NMR结果显示，FTO-OE株系干乳胶中的橡胶烃含量增加了40.37%至802.57%（图1K, L）。同时，FTO-OE株系的开花时间提前了8-20天，这对于生菜的乳胶收获有利，因为乳胶含量在抽薹和开花期间达到峰值（图S1J, K）。

图1

去甲基化酶FTO基因的过表达显著增加了生菜中的乳管指数和天然橡胶产量。A 西部印迹检测阳性株系。B PCR检测阳性株系。C RT-PCR检测阳性株系。D 总固体含量测定示意图。E FTO-OE株系乳胶的总固体含量测定。根（F）和茎（G）用碘-溴染色。乳管细胞（用黑色箭头标出）染色更深。H 用碘-溴染色的根中每列乳管细胞的相对面积。I 用碘-溴染色的茎中乳管细胞的相对面积。J 不同FTO-OE株系中NR的分子量（通过HPLC-GPC测定）。K 通过¹H-核磁共振（NMR）分析FTO-OE株系和野生型中的乳胶。NMR示意图。使用橡胶树的NR作为阳性对照。L 通过NMR测定的橡胶烃的相对浓度比。P ≤ 0.05，** P ≤ 0.01，*** P ≤ 0.001

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橡胶生物合成始于糖代谢途径，随后是MVA途径，其中IPP作为聚合的前体（Hu等人2024）。因此，我们测量了乳胶中的蔗糖和葡萄糖含量。结果显示，转基因株系中的蔗糖水平显著增加（图S2A），而葡萄糖含量显著降低（图S2B）。我们推测这种现象可能是由于葡萄糖被大量用于乙酰辅酶A的合成。为了进一步研究这一点，我们测定了叶片（图S2C, D）和乳胶（图S2E, F）中的乙酰辅酶A和异戊二烯焦磷酸（IPP）含量。结果表明，这些组织中转基因株系的乙酰辅酶A和IPP浓度显著高于野生型对照。

我们的研究表明，乳胶中的乙酰辅酶A含量与不同转基因株系中的橡胶烃含量并未表现出严格线性相关。这表明乙酰辅酶A可能不仅参与橡胶生物合成途径，还可能参与其他代谢过程，如脂肪酸合成。为了验证这一假设，我们量化了各种转基因株系乳胶中的丙酮酸脱氢酶（PDH）活性和脂肪酸含量。结果表明，OE-19和OE-40的酶活性和脂肪酸含量显著高于OE-23和OE-45（图S2G, H）。这一观察结果支持了乙酰辅酶A部分被转移到脂肪酸合成途径中的结论，从而导致乳胶中乙酰辅酶A浓度降低。

此外，为了检测FTO-OE转基因植物中的m⁶A修饰，我们使用MeRIP技术进行了m⁶A-seq，并结合RNA-seq进行了差异表达分析。m⁶A-seq结果显示，FTO过表达植物中的次生代谢物合成以及淀粉和糖代谢途径发生了m⁶A去甲基化（图S2J），表明与这些途径相关的基因可能更容易表达。我们发现保守的RRACH基序（R为A/G和H为A/C/U）和DRACH基序（D为A/G/U，R为A/G和H为A/C/U）的m⁶A峰显著富集（图S3A）。图S3B显示了所有测试样本的一个示例峰（LOC111891867）。我们对差异峰进行了GO和KEGG分析，结果表明与淀粉和蔗糖代谢以及次生代谢物生物合成相关的途径富集（图S3C, D）。随后，我们对m⁶A-seq和RNA-seq数据进行了综合分析。GO和KEGG分析结果表明，差异基因主要富集在淀粉和蔗糖代谢、次生代谢物生物合成以及硫代谢途径中（图S3E, F）。对两个数据集中的2,795个显著差异基因进行了象限图分析。共有27个基因（补充材料2）在m⁶A-seq和RNA-seq数据集中均显著（图S3G）。其中，三个基因（LOC111890627、LOC111908845和LOC111891867）在m⁶A去甲基化过程中表达水平上调。尽管检测到的基因较少，但结果与先前的研究结果一致（Yu等人2021）。接下来，qRT-PCR结果显示，三个去甲基化基因在FTO-OE株系中的表达水平显著上调，并且受到不同激素的进一步诱导（图S2I）。箱形图显示了基因表达水平如何受其甲基化状态的影响。似乎CDS区域的m⁶A修饰对基因表达有显著影响，而终止密码子区域含有最多的m⁶A修饰（图S3H）。

根据我们的发现，我们提出了FTO的作用模型（图S2L）。FTO的过表达导致生菜中与糖代谢途径和细胞发育分化相关的基因去甲基化。这导致天然橡胶合成底物乙酰辅酶A和IPP的增加，以及乳管细胞的增殖，最终提高了FTO株系的NR产量。

在这项研究中，我们证明了FTO在生菜中的过表达显著增强了乳管细胞的分化，并显著增加了NR的产量。我们的发现表明，RNA m⁶A修饰在调节橡胶生产中起着关键作用，其调控为大幅提高橡胶产量提供了有希望的策略。