对新鲜切割的西瓜吸水过程中分子机制的多组学解析

《Molecular Horticulture》：A multi-omics dissection of the molecular mechanisms underlying water soaking in fresh-cut watermelon

本研究采用多组学方法解析鲜切西瓜水浸泡的分子机制，发现乙烯信号通路、活性氧积累及细胞壁降解相关基因表达上调，DNA甲基化水平动态变化，非编码RNA通过海绵效应调控基因表达，共同驱动水浸泡发生。

　　

新鲜切割的西瓜极易发生水浸现象，这是一种生理障碍，其特征是果肉变暗，组织呈现半透明状态（Shi等人，2020）。水浸现象与细胞壁降解和细胞膜损伤密切相关，乙烯和活性氧（ROS）被认为是导致这一现象的关键因素（Hurr等人，2013）。虽然以往关于新鲜切割西瓜的研究主要集中在优化保鲜技术上，但其背后的分子机制仍不甚明了。因此，本研究采用多组学方法（包括转录组学、DNA甲基化分析和代谢组学）来探讨冷藏过程中新鲜切割西瓜水浸现象的分子基础。

在储存过程中，新鲜切割的西瓜水浸症状逐渐加重，同时可溶性固形物含量下降，过氧化氢（H?O?）和超氧阴离子（O??•）的积累增加（图1A；图S1、S2）。我们进行了代谢组学分析，以表征与此现象相关的代谢变化（图S3、S4；表S1-S6）。通过K均值聚类分析，将差异表达的代谢物（DAMs）分为18类并进一步归为6个簇（图S3；表S1-S6）。结果表明，大多数与水浸相关的代谢物表达下调，如L-谷氨酸、阿魏酸（钠盐）、还原型谷胱甘肽（GSH）、焦性没食子酸和2,4-二羟基苯甲酸；而对香豆醇的表达则上调（图S3）。此外，在储存期间D-阿拉伯糖和吡哆醛磷酸的水平也显著增加（图S3），这表明细胞壁降解和乙烯生物合成相关代谢活动增强。总体而言，这些代谢变化表明ROS积累、细胞壁解体以及乙烯产生在水浸现象的发生中起着重要作用。为进一步阐明其分子机制，我们进行了转录组学分析，以识别参与这一过程的关键基因（图1B-D；图S5、S6S7、S8）。比较WS-0d与后续时间点（WS-2d、WS-4d、WS-6d、WS-8d）的差异表达基因（DEGs）发现，这些基因主要富集在五个通路中：植物激素信号传导通路、MAPK信号通路、植物-病原体相互作用通路、戊糖和葡萄糖醛酸转化通路以及半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路（图S5）。随着储存时间的延长，参与乙烯生物合成的基因（如S-腺苷甲硫氨酸合成酶2/3（ClSAM2/3）、1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶1/2（ClACS1/2）和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶1（ClACO1）表达上调。同样，参与乙烯信号传导的关键基因（如乙烯受体2（ClETR2）、乙烯响应转录因子1（ClERF1）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶CTR1（ClCTR1）、EIN3结合F-box蛋白1（ClEBF1）和丝裂原活化蛋白激酶4（ClMKK4）也表现出表达增加（图1C），这表明乙烯在水浸现象的发生中起重要作用。同时，与ROS相关的基因（如钙依赖性蛋白激酶1/17/32（ClCPK1/17/32）、呼吸爆发氧化酶同源蛋白C（ClRBOHC）和鞭毛蛋白感应2（ClFLS2）的表达水平也升高（图1B），进一步促进了水浸现象的发展。此外，与细胞壁降解相关的基因（如果胶甲基酯酶7/36/51/61（ClPME7/36/51/61）、果胶裂解酶12（ClPL12）和聚半乳糖醛酸酶（ClPG）也表现出上调趋势（图S6），这可能加速了细胞壁的分解。综上所述，参与乙烯生物合成和信号传导、ROS产生以及细胞壁降解的基因上调可能是新鲜切割西瓜在储存过程中水浸现象发展的主要原因。

图1

对新鲜切割西瓜对水浸现象反应的分子机制进行了多组学分析。A 不同储存阶段新鲜切割西瓜外观的变化。B ClCPK1/17/32、ClRBOHC和ClFLS2基因的表达变化。C 乙烯生物合成和信号传导通路。热图显示了与乙烯生物合成和信号传导相关基因的表达变化。D 与水浸相关的关键代谢物含量的变化及其与关键基因之间的相关性分析。E 储存期间关键miRNA的表达水平变化。F miRNA及其预测靶基因的调控网络。G lncRNA-miRNA-mRNA的网络图。H 储存期间ClGGP1、ClWRKY46、ClCNGC16和ClRBOHA的表达谱。I 黑色垂直箭头表示下调。热图显示了五个储存阶段编码DNA甲基化酶和去甲基化酶的基因表达变化。J 新鲜切割西瓜水浸现象发展机制的模型。粗红色和蓝色箭头分别代表正相关和负相关；细红色和蓝色箭头表示基因上调和下调；加号和减号分别表示促进和抑制作用。

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与水浸现象相关的基因主要富集在植物激素信号传导通路、MAPK信号通路、植物-病原体相互作用通路、戊糖和葡萄糖醛酸转化通路以及半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路中。综合分析显示，这些关键DEGs与DAMs之间存在强相关性，它们在乙烯信号传导、ROS产生和细胞壁降解过程中起协同作用（|Pearson系数|>?0.7，P?1D；图S6），这表明它们在新鲜切割西瓜的储存过程中共同促进了水浸现象的发生。

为进一步阐明水浸现象的转录后调控机制，我们分析了非编码RNA，包括lncRNAs、miRNAs和circRNAs（图1E-H；图S7-S9S9–S13）。差异表达的lncRNAs（DElncRNAs）的靶基因也主要富集在植物激素信号传导通路、MAPK信号通路、植物-病原体相互作用通路以及戊糖和葡萄糖醛酸转化通路中（图S7）。值得注意的是，ClMKK4、ClCPK17、ClRBOHC、ClFLS2和ClPL12均作为DElncRNAs的靶基因显著上调（图S7），从而促进了水浸现象的发生。通常情况下，miRNAs会结合到目标mRNA的非翻译区（UTRs）上，抑制其翻译（Fabian等人，2010）。在本研究中，新发现的miR_11被预测为同时靶向WRKY转录因子46（ClWRKY46）和呼吸爆发氧化酶同源蛋白A（ClRBOHA）。此外，环核苷酸门控离子通道16（ClCNGC16被确定为五种不同miRNAs的靶基因（图1E, F；图S9）。WRKY46被认为在维持细胞壁结构中起作用（Bao等人，2023），RBOHA负责ROS的生成（Si等人，2022），CNGC16参与钙信号传导（Cui等人，2020）。这些基因的表达变化可能影响细胞壁和膜的完整性，从而导致新鲜切割西瓜的水浸现象。对于差异表达的circRNAs（DEcircRNAs），未发现直接参与水浸过程的miRNA或mRNA靶基因（表S12、S13），这表明circRNAs在此过程中可能不起重要作用。然而，先前的研究表明lncRNAs可以包含多个miRNA结合位点，充当“miRNA海绵”，参与竞争性内源性RNA（ceRNA）网络的构建，从而间接调控基因表达（Tay等人，2014）。在本研究中，我们构建了一个整合miRNA、mRNA和lncRNA数据的ceRNA网络，其中包括WRKY46（ClG42_09g0094600、CNGC16（ClG42_06g0179700和GDP-L-半乳糖磷酸化酶1（ClGGP1）（图1G）。GGP1（ClG42_09g0109600参与ROS清除（Yang等人，2024）。值得注意的是，尽管这些基因是miRNAs的靶基因，但它们的表达仍然上调（图1H）。它们的上游lncRNAs也表现出高表达水平（图S8），这表明lncRNAs可能作为miRNA海绵，竞争性地结合miRNAs，从而降低其有效浓度，从而缓解了与水浸相关的mRNA的抑制作用，使其能够正常或上调表达。总之，参与乙烯生物合成和信号传导、ROS产生以及细胞壁降解的基因上调可能是新鲜切割西瓜在储存过程中水浸现象发展的驱动因素。

我们还在不同储存阶段的样本上进行了全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）（图1I；图S10、S11S14、S15）。甲基化分析显示，功能区域的CG甲基化水平在最初的四天内增加，随后下降。在CHG和CHH背景下，甲基化变化主要发生在上游2 kb、内含子和下游2 kb区域，第0天的甲基化水平最低，之后略有上升（图S11）。差异甲基化区域（DMR）分析表明，随着时间的推移，高甲基化DMR减少，低甲基化DMR增加，且高甲基化DMR在CHH背景下富集（图S11S10）。总体而言，储存期间全基因组的DNA甲基化水平下降，尤其是在CHH背景下（与番茄中的结果一致，Li等人，2024）。

此外，负责维持CHH甲基化的染色质甲基化酶2（ClCMT2和结构域重排甲基化酶1（ClDRM2）以及参与RNA定向DNA甲基化（RdDM）途径的关键基因在储存期间的表达水平也下降（图1I）。特别是，关键RdDM基因（如ClAGO4）的下调可能导致多个RdDM靶位的CHH甲基化减少（Duan等人，2015）。同时，与DNA去甲基化相关的转录激活因子DEMETER（ClDME的表达在储存期间逐渐增加（图1I）。这些发现表明，水浸过程中观察到的DNA甲基化下降可能是由于甲基化活性降低和去甲基化过程增强共同作用的结果。

通过整合转录组学和DNA甲基化数据，我们发现ClSAM3、ClACS、ClERF1、ClEBF1和ClMKK4的高表达水平与CHH甲基化水平的升高相关（图S11）。相反，ClACO、ClCPK32、ClPL12和ClPME7/36/51等基因的表达与低CHM甲基化和高转录本丰度呈负相关（图S11

总之，新鲜切割西瓜的水浸现象受到乙烯、ROS、细胞壁降解相关基因和代谢物的共同影响，并进一步受到DNA甲基化和非编码RNA的调控（图1J）。我们的研究不仅加深了对储存过程中水浸现象分子机制的理解，还为未来精准控制新鲜切割西瓜的水浸现象提供了理论基础。