解密中药钩藤基因组：揭示单萜吲哚生物碱代谢通路及其转录调控机制

《Molecular Horticulture》：The genome of the medicinal plant Uncaria rhynchophylla provides new insights into monoterpenoid indole alkaloid metabolism and its molecular regulatory mechanism

本文报道了药用植物钩藤的首个染色体级别基因组组装，填补了该物种基因组资源的空白。研究结合基因组学、转录组学和代谢组学分析，系统鉴定了钩藤中单萜吲哚生物碱(MIA)生物合成的关键酶基因及其调控网络。功能验证证实UrTDC6和UrLAMT1/UrLAMT2分别为色胺和栀子苷合成的关键酶；相关性分析发现UrWRKY37是调控MIA通路的核心转录因子，其通过直接激活UrTDC和UrSGD的转录，显著提升毛状根中异去氢钩藤碱、去氢钩藤碱和异钩藤碱等活性生物碱的积累。这项工作为通过合成生物学策略提高钩藤活性成分产量奠定了重要的分子基础。

　　

钩藤高质量基因组图谱的绘制

研究首先对钩藤进行了染色体级别的高质量基因组测序与组装。利用牛津纳米孔测序(ONT)、Illumina NovaSeq和Hi-C技术，获得了大小为627.70 Mb、contig N50为1.80 Mb的基因组草图，并将其锚定到22条染色体上。BUSCO评估显示基因完整性达96.1%，表明组装质量高。基因组注释共预测出46，909个编码基因，其中转座元件(TEs)占比39.10%，长末端重复序列(LTRs)是主要的重复类型。系统发育分析表明，钩藤与咖啡、栀子同属茜草科，约在4470万年前发生分化。基因组资源的获得为后续解析其药用活性成分的生物合成与调控机制提供了关键平台。

钩藤中MIA的组织特异性积累模式

通过靶向代谢组学分析，研究了钩藤根、茎钩和叶三种组织中十种典型单萜吲哚碱(MIAs)的积累情况。结果显示，大多数具有生物活性的成分，如钩藤碱(RIN)、异钩藤碱(IRN)、去氢钩藤碱(COX)、异去氢钩藤碱(ICOX)、柯诺辛和钩藤碱E等，在茎钩中的积累量显著高于根和叶。这解释了为何传统中药以带钩茎枝入药。仅有少数MIA如喜树次碱和喜树碱在根中积累更高，而异钩藤酸和柯诺辛碱B仅在根中检出。

MIA生物合成关键酶基因的功能验证

基于基因组数据，研究筛选出64个参与RIN和IRN上游生物合成途径的候选基因。重点关注了两个限速步骤的关键酶。

1. 1.
   UrTDC6催化色胺合成：在钩藤基因组鉴定的6个UrTDC基因中，仅UrTDC6表达可检测，且在茎钩中表达最高。该基因编码509个氨基酸，属于芳香族L-氨基酸脱羧酶家族。原核表达纯化获得重组UrTDC6蛋白，酶活实验证实其能以L-色氨酸为底物催化生成色胺。该酶最适反应温度为50°C，最适pH为7.0，Cu²⁺强烈抑制其活性。动力学分析显示其K_m值为0.53 mM，k_cat为0.14 s^-1。分子对接揭示了其活性口袋中的关键残基。
2. 2.
   UrLAMT1和UrLAMT2催化栀子苷合成：鉴定出两个UrLAMT基因。酶活实验证明，重组UrLAMT1和UrLAMT2蛋白均能催化栀子酸(loganate)转化为栀子苷(loganin)。UrLAMT1和UrLAMT2的最适温度均为40°C，最适pH分别为7.0和6.0。动力学分析显示，UrLAMT2对底物的亲和力更高(K_m= 49.77 μM)，而UrLAMT1的转换数更高(k_cat= 0.0176 s^-1)。

钩藤WRKY转录因子家族的基因组学分析

研究系统鉴定了钩藤基因组中的WRKY转录因子家族，共发现72个UrWRKY基因。根据保守结构域和系统发育关系，它们被分为三个主要类群：Group I (17个)、Group II (47个，含5个亚组)和Group III (8个)。其中6个成员含有变异的WRKYGKK结构域。基因复制事件分析表明，片段重复是UrWRKY家族扩张的主要驱动力。启动子顺式元件分析发现这些基因的启动子区富含激素响应、非生物胁迫响应等元件。

核心转录因子UrWRKY37的鉴定与功能解析

通过MIA含量与基因表达的相关性分析，并结合同源基因功能线索，研究锁定UrWRKY37为关键候选调控因子。其表达水平与多数MIA含量呈显著正相关。UrWRKY37属于Group I，含有两个WRKYGQK保守域和C₂H₂锌指结构，定位于细胞核。

1. 1.
   体外验证调控活性：双荧光素酶报告基因(Dual-LUC)实验证明，UrWRKY37能够显著激活UrTDC和UrSGD基因的启动子。酵母单杂交(Y1H)实验进一步证实，UrWRKY37可以直接结合到UrTDC和UrSGD启动子的W-box元件上。
2. 2.
   体内过表达验证：在钩藤毛状根中过表达UrWRKY37。结果显示，与空载体对照相比，转基因毛状根中异去氢钩藤碱、去氢钩藤碱和异钩藤碱的含量分别显著增加了约51%、12%和41%。同时，MIA生物合成通路中多数基因的表达被上调，特别是UrTDC、UrSTR、UrSLS和UrLAMT。这直接证明了UrWRKY37通过激活下游关键酶基因的表达，正向调控钩藤MIA的生物合成与积累。

总结与展望

本研究成功绘制了药用植物钩藤的首个染色体级别基因组，为这一重要中药资源的分子生物学研究提供了核心数据。研究不仅功能鉴定了MIA合成途径中的两个关键酶——UrTDC6和UrLAMT1/UrLAMT2，更重要的是发现并验证了转录因子UrWRKY37的核心调控作用。UrWRKY37通过直接激活UrTDC和UrSGD等基因，形成一个有效的调控网络，显著提升活性生物碱的产量。这项工作从“关键酶基因”和“转录调控因子”两个维度，为通过代谢工程和合成生物学手段可持续、高效地生产钩藤活性成分（用于治疗高血压和阿尔茨海默病等）提供了全新的策略和关键的分子工具。未来，利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术对UrWRKY37进行深入操作，有望进一步优化钩藤的药用品质。