端粒到端粒单体型基因组为探究绿萼梅花型花色缺乏的分子机制提供新视角

《Molecular Horticulture》：The telomere-to-telomere haplotype genome provides in-depth insights into the molecular mechanisms of the anthocyanin deficiency phenotype in Prunus mume

这篇研究论文报道了绿萼梅(Prunus mume f. viridicalyx)的首个无间隙T2T（端粒到端粒）单体型基因组。研究通过整合多种测序技术，构建了两个高质量的单倍型基因组（LE_hap1和LE_hap2）。与以往梅花基因组相比，其完整性、连续性和准确性均得到显著提升。核心发现是，通过比较基因组学、群体遗传和分子生物学证据，研究人员确定PmGSTF2基因的过早密码子终止突变是导致绿萼梅型花色（尤其是花青素）积累受抑制的关键调控基因，这一发现为梅花花色育种和基因挖掘提供了宝贵的基因组资源和分子理论基础。

　　

高质量基因组的组装与鉴定

研究人员综合利用Oxford Nanopore超长读长、PacBio HiFi和Hi-C等多种测序技术，首次成功组装了绿萼梅(Prunus mume f. viridicalyx)的端粒到端粒无间隙单体型基因组。组装出的两个单倍型基因组LE_hap1和LE_hap2大小分别为229.29 Mb和228.36 Mb，连续性（contig N50）分别达到27.65 Mb和27.79 Mb，预测的蛋白质编码基因数量分别为24,318和24,316个。基因组质量评估指标，如BUSCO评估显示超过98.9%的核心真核基因完整，长末端重复组装指数(LAI)达到“黄金标准”(>20)，以及较高的共识质量值(QV)，均证实了该基因组组装的高质量、完整性和准确性。研究者还在每条染色体的末端鉴定出端粒序列，并预测了16条染色体的着丝粒区域。

比较与进化分析揭示基因组特征

将绿萼梅基因组与其他李属(Prunus)植物进行比较，发现绿萼梅与同为栽培变种的‘曲梗梅’(P. mume var. tortuosa)亲缘关系更近，它们约在447万年前分化，而它们的共同祖先与野生梅花的分化时间约为759万年前。比较分析显示，绿萼梅相对于野生梅花，有40个基因家族显著扩张，48个基因家族显著收缩。这些特异性基因在类胡萝卜素生物合成过程和谷胱甘肽代谢过程等通路中显著富集。转座子分析表明，绿萼梅基因组中的长末端重复反转录转座子(LTR)数量和比例显著高于野生梅花，尤其在Gypsy和Copia元件上，暗示了栽培种基因组经历了更近期的扩张事件。

选择性清除与关键基因的发掘

为探究绿萼梅型花色性状（花萼、幼叶等部位缺乏花青素）的驯化分子机制，研究者对野生梅花和绿萼梅型样本进行了群体重测序分析。系统发育树和群体结构分析均清楚地将两者分为两大支系。选择性清除分析发现，在绿萼梅群体中，第四号染色体上存在一个高度选择和高连锁的区域（LG04-LD1，1.08-1.10 Mb）。该区域内定位到一个谷胱甘肽S-转移酶基因PmGSTF2。

深入分析发现，在绿萼梅型样本群体中，PmGSTF2基因的第307位碱基由G突变为T，导致其编码的第103位谷氨酸密码子突变为终止密码子，产生提前终止翻译的蛋白质截短突变。该突变在绿萼梅群体中固定存在，而在野生群体中不存在。研究测量发现，绿萼梅型样本幼叶中的花青素含量显著低于非绿萼梅型样本，且PmGSTF2基因的表达水平也相应显著降低。

基因功能验证证实PmGSTF2的作用

为了验证PmGSTF2的功能，研究者进行了功能互补和基因敲除实验。他们将拟南芥(Arabidopsis thaliana)的花青素转运蛋白基因gst突变体，分别回补截短型(PmGSTF2-S)和完整型(PmGSTF2-L)的梅花PmGSTF2基因。结果显示，回补完整基因的转基因植株在光处理下恢复了叶片花青素的积累和红色表型，其花青素含量和PmGSTF2表达量与野生型拟南芥无显著差异；而回补截短基因的植株则与gst突变体类似，无法积累花青素。

进一步，研究者在梅花‘美人’品种的愈伤组织中进行CRISPR/Cas9介导的PmGSTF2基因敲除实验。在紫外光照射下，成功转化的愈伤组织发出黄绿色荧光，而在正常光下，野生型愈伤组织呈现红色，而PmGSTF2敲除的愈伤组织变为绿色，表明敲除PmGSTF2抑制了愈伤组织中的花青素积累。对靶位点的测序也证实了多种移码突变和提前终止密码子的产生，导致基因功能失活。

最后，通过不同杂交组合的后代表型分离比验证，发现PmGSTF2基因的突变与绿萼性状是完全共分离的，符合孟德尔遗传规律，进一步确定了该基因是控制绿萼梅花色缺乏的关键基因。

1 seedlings in different hybrid combinations. a The overall phenotype of F₁seedlings in the hybrid combination of P. mume f. viridicalyx and P. mume Xiao Lve; (b) Partial phenotypic differences between F₁seedlings of P. mume f. viridicalyx and P. mume Xiao Lve hybrid combinations; (c) Schematic diagram of P. mume f. viridicalyx and P. mume Xiao Lve hybrid combinations and the number of different phenotypes in F₁generation; (d) The overall phenotype of F₁seedlings in the hybrid combination of P. mume f. viridicalyx and P. mume Yanglao No.2; (e) Partial phenotypic differences between F₁seedlings of P. mume f. viridicalyx Lve and P. mume Xiao Lve hybrid combinations; (f) Schematic diagram of P. mume f. viridicalyx and P. mume Yanglao No.2 hybrid combinations and the number of different phenotypes in F₁generation; (g) The overall phenotype of F₁seedlings in the hybrid combination of P. mume Yanglao No.2 and P. mume Gucheng No.1; (h) Partial phenotypic differences between F₁seedlings of P. mume Yanglao No.2 and P. mume Gucheng No.1 hybrid combinations; (i) Schematic diagram of P. mume Yanglao No.2 and P. mume Gucheng No.1 hybrid combinations and the number of different phenotypes in F₁generation">