Anle 138b与甲基-β-环糊精之间的主客体复合物：体外特性研究及潜在的抗帕金森病制剂开发

《International Journal of Pharmaceutics》：The host–guest inclusion complex of Anle 138b with Methyl-β-cyclodextrin: In vitro characterization and possible formulation development for anti-Parkinson application

本研究通过将抗帕金森药物Anle 138b与甲基-β-环糊精形成包合物，显著提高其水溶性（达300倍），并利用核磁共振、X射线衍射等方法证实包合物结构，同时评估其细胞毒性和抑制α-突触蛋白聚集的活性，为开发鼻内给药制剂奠定基础。

　　

朱迪塔·科兰杰洛（Giuditta Colangelo）|安娜·玛丽亚·迪·科索拉（Anna Maria Di Cosola）|罗莎·安杰拉·卡多内（Rosa Angela Cardone）|尼古拉·马尔吉奥塔（Nicola Margiotta）|洛伦佐·格拉（Lorenzo Guerra）|马可·格雷科（Marco Greco）|德博拉·穆萨罗（Debora Musarò）|萨尔瓦托雷·佩特拉利亚（Salvatore Petralia）|朱塞佩·弗拉基奥拉（Giuseppe Fracchiolla）|皮耶尔·詹尼·梅达利亚（Pier Gianni Medaglia）|费德里科·德莱·法韦（Federico Delle Fave）|罗莎娜·马拉马奇（Rosanna Mallamaci）|米凯莱·马菲亚（Michele Maffia）|阿德里亚娜·特拉帕尼（Adriana Trapani）|斯特凡诺·卡斯特拉尼（Stefano Castellani）

意大利福贾大学临床与实验医学系，邮编71122，福贾

摘要

Anle 138b作为一种抗帕金森病（PD）药物进行了研究，其作用机制是通过抑制α-突触核蛋白（α-syn）的聚集。研究发现其在25°C下的水溶性低于1 μM，因此尚未针对制药市场开发出任何液体制剂。在本研究中，我们探讨了基于α-突触核蛋白聚集抑制剂与甲基-β-环糊精（Me-β-CD）包合物（ICX）的制剂在鼻腔给药方式下的性能。首先，Anle 138b/Me-β-CD ICX显著提高了Anle 138b的溶解度（几乎是单独使用时的300倍）。通过¹H核磁共振（NMR）光谱获得了有关Anle 138b/Me-β-CD ICX的结构信息，该光谱显示了由构象体和互变异构体引起的信号。此外，还通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和X射线衍射（XRD）进一步评估了这种包合物，结果表明其结晶状态有所降低，转变为无定形状态，这一点从XRD谱图中宽泛的吸收峰可以得到证实。虽然紫外-可见光（UV–Vis）光谱提供了ICX形成的弱证据，但相溶性研究提供了更有力的证据，显示其具有1:1的化学计量比。在嗅鞘细胞上进行的细胞相容性测试表明，在Me-β-CD浓度高达2.5 μM、Anle 138b浓度高达10 μM的情况下，Anle 138b/Me-β-CD ICX制剂不会引起细胞毒性。最后，体外硫黄素T（Thioflavin T）实验表明，Anle 138b/Me-β-CD ICX在抑制α-突触核蛋白聚集方面的效果与游离的Anle 138b相当甚至更优。因此，基于ICX的固体剂型在抗帕金森病应用中具有潜力。

引言

对于60岁以上的人群来说，帕金森病（PD）是仅次于阿尔茨海默病的第二大神经退行性疾病，会导致进行性的运动障碍（Shastry, 2001），同时还会伴随认知障碍，使患者出现神经功能障碍。PD在全球范围内都有发生，男性发病率似乎更高（Abou-Sleiman et al., 2006）。该病的发病机制主要是由于黑质（Substantia Nigra）中多巴胺（DA）水平下降，此时可观察到路易小体（Lewy bodies）和路易神经炎（Lewy neuritis）等异常现象（Spillantini et al., 1997）。由于多巴胺具有亲水性，无法穿越血脑屏障（BBB），因此无法直接将其用于PD患者的治疗。目前市场上使用的主要疗法是L-多巴（L-DOPA），但长期使用L-多巴常会伴随多种副作用，影响患者的生存质量（如“药效减退”现象、剂量波动和运动障碍）。

过去十年中，在脑递送领域最重要的研究成果之一是可以通过鼻腔给药的方式有效绕过血脑屏障，将治疗剂输送到中枢神经系统（CNS）（Agrawal et al., 2020, Saha and Rafe, 2023, Wen and Ren, 2024）。这种方法是一种非侵入性的策略，利用鼻腔与嗅球或三叉神经之间的解剖连接，使药物直接到达CNS。因此，对于PD治疗而言，鼻腔到大脑（NTB）的药物递送方式显得非常有前景。NTB主要是一种非侵入性的给药方式，能够通过减少酶促降解和系统性不良反应来提高药物的脑内生物利用度（Trapani et al., 2004）。

为了优化NTB递送途径，药物剂型与鼻黏膜之间的适当相互作用可以增加药物在鼻腔内的停留时间，并减少药物的黏液清除。已知“渗透增强剂”能够改善药物通过鼻腔上皮细胞的传输，从而有助于将药物递送到CNS。环糊精（CDs）作为一种重要的渗透增强剂，已被广泛研究证明具有显著的效果（Jansook et al., 2018）。CDs由六到八个葡萄糖单元组成，适用于多种给药途径的制剂。由于其截锥形状，CDs可以与难溶的药物分子形成主客体包合物，从而提高其溶解度、溶解速率、稳定性和生物利用度（Carrier et al., 2007, Loftsson and Brewster, 1996）。此外，CDs的亲水结构和高分子量使其无法穿透脂质生物膜，因此对膜没有影响（Jansook et al., 2018）。

基于这些原理，我们研究了通过鼻腔给药的方式，利用α-突触核蛋白（α-syn）聚集抑制剂Anle 138b（即3-(1,3-苯并二氧环戊基)-5-(3-溴苯基)-1H-吡唑，图1）来递送药物。

Anle 138b是一种新发现的α-突触核蛋白寡聚化抑制剂，在临床前研究中显示出良好效果，其抑制机制也通过计算机模拟方法得到了深入研究（Antonschmidt et al., 2022, Grewal et al., 2024, Kondratyev et al., 2022, Reiner et al., 2018）。然而，Anle 138b的水溶性较低，在25°C时低于1 μM，因此提高其水溶性是一个重要的生物制药挑战。

本研究的目的是评估将Anle 138b与Me-β-CD包合的策略，以增加其水溶性，使其适合制成鼻腔滴剂等剂型。此外，这种固体包合物（CX）也可以作为药物开发的起点，例如鼻腔粉末。在这两种情况下，所提到的制剂都可以通过NTB途径递送到CNS（图1）。选择亲水且市售的Me-β-CD是因为它已被证明对鼻腔给药途径基本无毒（Merkus et al., 1999），并且能够促进药物的鼻腔吸收（Rassu et al., 2018）。此外，选择Me-β-CD还因为其他研究表明它能够减少α-突触核蛋白的聚集，保护多巴胺能神经元（Min et al., 2023）。不过，Me-β-CD在与膜脂质相互作用和胆固醇提取过程中也可能表现出浓度依赖性的细胞毒性。研究表明，甲基化的β-环糊精通常具有较低的IC₅₀值，低浓度时通常耐受性良好，例如在NGF分化的PC12细胞模型中，浓度约为1–2 μM时细胞存活率不受影响，而高浓度时则会出现毒性（Kiss et al., 2010, Ulloth et al., 2007）。最近的相关综述也总结了CDs在鼻腔应用中的安全性，表明适当剂量的制剂使用时不会产生严重的毒性问题（Rassu et al., 2021）。

据我们所知，这是首次研究涉及3,5-不同取代的1H-吡唑（如Anle 138b）在溶液中的特殊平衡，以及基于Anle 138b/Me-β-CD ICX的剂型开发优势。

为此，我们采用了多种方法来验证Anle 138b/Me-β-CD包合物（ICX）的形成，包括紫外-可见光和傅里叶变换红外光谱、X射线衍射、¹H NMR分析，以及溶解度和相溶性研究，并在模拟鼻腔液（SNF）中进行了体外药物释放实验。此外，使用嗅鞘细胞（OECs）进行的细胞活力研究和硫黄素T实验也有助于了解Anle 138b/Me-β-CD ICX的生物学性能。

材料

3-(1,3-苯并二氧环戊基)-5-(3-溴苯基)-1H-吡唑（Anle 138b）粉末购自意大利米兰的DBA公司。根据制造商说明，通过HPLC检测，Anle 138b的纯度大于98%。甲基-β-环糊精（Me-β-CD，分子量1320 Da，批号71P001，DS 1.78，通过¹H NMR检测纯度≥98%）由意大利米兰的Wacker Chemie公司赠送，并在室温下保存在干燥器中直至使用。

结果

为了评估Anle 138b与Me-β-CD的包合物形成策略，从而开发适合鼻腔给药的液体或固体剂型，我们按照冷冻干燥方法制备了这种抑制剂的包合物，使用了等量的反应物（Saha and Rafe 2023）。通过紫外-可见光和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）以及X射线衍射技术检测了ICX的形成。

讨论

在本研究中，我们重点关注了通过冷冻干燥方法制备Anle 138b与水溶性Me-β-CD之间的包合物，作为开发适合鼻腔给药的剂型的基础。当Anle 138b/Me-β-CD ICX经过冻干处理后，获得了较高的产率（65 ± 5%，表1），这表明冷冻干燥是一种有效的制备方法。

结论

通过使用冷冻干燥技术，我们成功制备了α-突触核蛋白抑制剂Anle 138b与Me-β-CD之间的主客体包合物，为通过NTB途径进行鼻腔给药治疗帕金森病（及其他突触核蛋白疾病）的药物开发奠定了基础。¹H NMR和紫外光谱的结果证实了Anle 138b的有效包封。

作者贡献声明

朱迪塔·科兰杰洛（Giuditta Colangelo）：撰写原始草稿，参与研究。安娜·玛丽亚·迪·科索拉（Anna Maria Di Cosola）：撰写原始草稿，参与研究。罗莎·安杰拉·卡多内（Rosa Angela Cardone）：参与研究。尼古拉·马尔吉奥塔（Nicola Margiotta）：数据管理。洛伦佐·格拉（Lorenzo Guerra）：数据可视化。马可·格雷科（Marco Greco）：参与研究。德博拉·穆萨罗（Debora Musarò）：参与研究。萨尔瓦托雷·佩特拉利亚（Salvatore Petralia）：方法学研究。朱塞佩·弗拉基奥拉（Giuseppe Fracchiolla）：参与研究。皮耶尔·詹尼·梅达利亚（Pier Gianni Medaglia）：数据管理。费德里科·德莱·法韦（Federico Delle Fave）：参与研究。罗莎娜·马拉马奇（Rosanna Mallamaci）：撰写原始草稿，参与研究。米凯莱·马菲亚（Michele Maffia）：

利益冲突声明

作者声明以下可能的财务利益或个人关系可能构成利益冲突：阿德里亚娜·特拉帕尼（Adriana Trapani）表示得到了西西里Micronanotech研究与创新中心的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究由“西西里Micronanotech研究与创新中心研究计划 – SAMOTHRACE（ECS00000022）Nextgeneration EU- CUP E63C22000900006”资助。A.T. 还感谢米兰IMCD公司的Marco Isgro’博士和巴里大学的Fabio Feolo博士在环糊精方面的帮助。