《JHEP Reports》：Molecular endoscopy with Next-Generation Sequencing improves diagnosis of cholangiocarcinoma in patients with extrahepatic biliary strictures
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为解决肝外胆管狭窄患者胆管癌(CCA)诊断敏感性不足的难题，本研究前瞻性地将靶向二代测序(NGS)应用于经单操作者胆道镜(SOC)获得的样本，并与传统细胞组织学和荧光原位杂交(FISH)进行比较。研究结果显示，NGS对恶性肿瘤的敏感性(82.2%)显著高于单独的细胞组织学检查(59.2%， P=1.9x10-3)，二者联合更将敏感性提升至89.5%。此外，该方案还在96.1%的恶性病例中成功实现了早期分子分型。这表明将NGS整合进常规诊断流程，可提高诊断效能、减少诊断延迟，并为治疗决策提供关键的分子信息。
肝外胆管狭窄(EBS)的良恶性鉴别一直是临床上棘手的难题。这些狭窄可能源于胆管癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤，也可能是由原发性硬化性胆管炎(PSC)等良性炎症性疾病引起。对于PSC患者，其发生胆管癌的风险更是比普通人群高出400倍。临床上，内镜逆行胰胆管造影(ERCP)虽为诊断“金标准”，但通过刷检或活检进行传统细胞组织学检查的敏感性有限（约45-67%），这导致许多患者需要反复接受侵入性检查，并面临诊断延迟和治疗决策滞后的困境。此外，胆道恶性肿瘤（如胆管癌）常伴有特定的基因突变，如KRAS、TP53、IDH1/2等，这些突变已成为重要的治疗靶点。因此，如何在初次诊断时就能获得准确的病理结果并同时了解肿瘤的分子特征，从而尽早开启靶向治疗，是临床亟需解决的核心问题。为了应对这一挑战，研究者们将目光投向了二代测序技术。近期发表于《JHEP Reports》的这项研究，系统评估了将靶向二代测序(NGS)整合到常规内镜诊断流程中，对于提升肝外胆管狭窄诊断准确性和实现早期分子分型的价值。
本研究的关键技术方法主要包括：首先，前瞻性招募了104名肝外胆管狭窄或疑似胆管癌患者，所有样本均通过优化的单操作者胆道镜(SpyGlass?)系统采集。其次，对采集的刷检和活检样本进行了标准的细胞组织学评估。再次，对所有样本进行靶向DNA二代测序，使用包含50个基因的自定义panel进行单核苷酸变异和拷贝数变异检测。最后，在一个42名患者的亚组中，回顾性进行了荧光原位杂交(FISH)分析，并与NGS和细胞组织学的诊断性能进行比较。
结果
Cohort description
研究纳入了104名患者，共进行了127次操作，最终76名患者(73.1%)确诊为恶性，28名(26.9%)为良性。共收集了445份样本。
Cytohistological examination
在90例最终诊断为恶性的操作中，细胞组织学检查仅检出52例阳性，敏感性为57.8%，表明单独使用传统病理方法会漏诊大量恶性病例。
DNA qualification and sequencing
DNA测序分析显示，与活检样本相比，刷检样本的DNA质量更优。在最终诊断为恶性且有可用材料的86例操作中，81.4%检出了致病性变异。这表明从胆道刷检样本中成功进行NGS分析具有高度可行性，为恶性病变的分子检测提供了可靠材料。
FISH analysis
在42名患者的亚组中，FISH检测的敏感性为81.2%，但特异性较低(50%)，且有16.7%的样本无法判读。相比之下，NGS在该亚组中的特异性为100%。
Comparison of the diagnostic performances of cytohistology, NGS and FISH
在整个队列中，NGS对恶性肿瘤的敏感性(82.2%)显著高于细胞组织学单独检测(59.2%)。将NGS与细胞组织学联合应用，敏感性进一步提升至89.5%，诊断准确率达到91.3%。在42名患者的亚组中，NGS与细胞组织学联合的敏感性高达97.2%，优于单独的细胞组织学(66.7%)、FISH(81.2%)以及细胞组织学与FISH的联合(86.1%)。这表明在诊断肝外胆管狭窄方面，NGS的效能优于FISH，且与细胞组织学联用效果最佳。
Subanalysis of Patients with primary sclerosing cholangitis
在13名PSC患者中，分子分析成功检出了两名最终发展为高级别不典型增生/胆管癌患者的致癌性变异。其中一个病例的追踪显示，KRAS和TP53致病性变异在细胞组织学确认癌变前四年多即被NGS检出，且变异等位基因频率(VAF)随病程进展而升高。这提示NGS可能比传统病理学更早地发现PSC相关的恶性转化信号。
DNA molecular profiling of malignancies
在确诊为恶性的76名患者中，DNA分子分型在73名(96.1%)患者中成功进行。在胆道恶性肿瘤中，最常见的分子改变包括TP53(27例)、KRAS(23例)、SMAD4(12例)和CDKN2A(11例)突变。还检出了包括BRAFV600E在内的可靶向突变以及ERBB2扩增。这证明通过内镜样本进行早期分子分型，识别治疗靶点是可行的。
Exploratory RNA sequencing analysis
在选定的一部分恶性样本中进行了探索性RNA测序。虽然在一例胆管癌样本中鉴定出一个意义不明的EGFR重排，但超过一半的样本(53.6%)由于RNA质量或数量不足而无法分析。这表明目前从ERCP衍生样本中进行RNA分子谱分析的可行性有限，仍需方法学优化。
研究结论与重要意义
本研究得出结论：将靶向二代测序(NGS)与细胞组织学评估相结合，能显著提高通过单操作者胆道镜获得的肝外胆管样本对胆管癌的诊断性能。这种联合策略不仅将诊断敏感性提升至近90%，其准确性也超过传统的细胞组织学或FISH检测。更重要的是，该方案能在初次诊断时，对96%以上的恶性病例成功实现早期分子分型，识别出如KRAS、TP53、BRAFV600E突变及ERBB2扩增等潜在的治疗靶点。对于原发性硬化性胆管炎(PSC)这一高危且诊断困难的群体，NGS甚至能在形态学证据出现前数年探测到致癌性分子变异，为极早期的干预提供了可能。
这项研究的意义在于，它为解决肝外胆管狭窄的临床诊断困境提供了一个强有力的整合方案。该方案优化了诊断流程，仅需常规刷检操作中分出的少量样本即可完成高灵敏度检测，减少了对额外侵入性活检的依赖。通过“一次操作，双重收获”——即同时获得精确的病理诊断和全面的分子图谱，有望大幅缩短患者的诊断时间，避免不必要的重复检查，并直接为后续的靶向或个体化治疗决策提供关键依据，从而真正实现诊断与治疗的无缝衔接。尽管在RNA分析、大Panel基因覆盖和成本效益等方面仍存在局限，但本研究无疑为推动胆管癌的精准诊疗实践迈出了坚实的一步。
