《Journal of Agriculture and Food Research》：Insights into the cytotoxicity of
Ganoderma adspersum mycelium extracts against human renal cancer cell lines
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本研究针对肾细胞癌的治疗需求，探索了药用真菌 Ganoderma adspersum 的生物活性。研究人员发现，该真菌的菌丝体乙醇提取物 (Gad mycelium extract) 在 125–500 μg/mL 浓度范围内，能特异性诱导人肾癌细胞（786-O, RCC-Shaw）凋亡，而对非肿瘤肾细胞（HK-2）毒性较低。机制研究表明，提取物中的腺苷 (adenosine) 通过激活过度表达的腺苷 A3受体 (ADORA3) 介导了抗增殖作用。该研究为开发源自 G. adspersum 的、具有选择性的新型抗癌先导化合物提供了重要依据。
在抗癌药物的漫长探索中，大自然始终是灵感与活性成分的宝库。真菌，作为天然产物的重要来源，其诸多物种已被证实拥有抗癌潜力。其中，灵芝属 (Ganoderma spp.) 真菌在传统医学中应用已久，现代研究也揭示了其多糖、三萜等成分的抗肿瘤、抗氧化等广泛生物活性。然而，同为灵芝属的 Ganoderma adspersum (G. adspersum) 虽然分布于南欧等地，并已显示出抗菌、抗氧化及对乳腺癌细胞的初步抗增殖效果，但其在对抗其他类型癌症，尤其是肾细胞癌方面的功效，仍是一片有待深耕的“蓝海”。肾细胞癌是最常见的肾脏恶性肿瘤，现有治疗方法有限且副作用明显，因此，从天然来源中寻找高效低毒的新型治疗剂显得尤为迫切。这项发表在《Journal of Agriculture and Food Research》上的研究，正是为了填补这一空白，系统地评估了 G. adspersum 提取物对人肾癌细胞的抗增殖活性及其潜在作用机制。
研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，制备了两种 G. adspersum 乙醇提取物，分别来自发酵后的液体培养基 (Fermented PDB) 和真菌菌丝体 (Gad mycelium)。其次，使用人肾癌细胞系（转移性 Caki-1、原发性 786-O 和 RCC-Shaw）以及非肿瘤人肾近端小管上皮细胞系 (HK-2) 进行体外细胞实验。核心的细胞活性检测采用 Alamar Blue 法，并通过光学显微镜、膜联蛋白 V/碘化丙啶 (Annexin V-FITC/PI) 染色、Caspase 3/7 活性检测及 Western Blot 分析（检测 Bcl-2, Bax, cleaved-PARP1 等蛋白）来探究细胞死亡机制。此外，研究采用核磁共振波谱 (NMR) 对两种提取物进行代谢组学分析，以鉴定其主要代谢物成分。最后，基于 NMR 结果，选取富集的单体化合物（琥珀酸、丙氨酸、腺苷）及其受体激动剂/拮抗剂进行功能验证实验。
3.1. Fermented PDB 乙醇提取物对人肾细胞活力的影响
研究发现，Fermented PDB 提取物在高达 1000 μg/ml 的浓度下，对三种肿瘤肾细胞系（Caki-1, 786-O, RCC-Shaw）的活力均无显著影响。然而，该高浓度对非肿瘤 HK-2 细胞产生了时间和浓度依赖性的细胞毒性，72小时后细胞活力降至约60%。这提示 Fermented PDB 提取物缺乏对肿瘤细胞的选择性抑制作用，且高浓度下对正常肾细胞有害。
3.2. Gad 菌丝体乙醇提取物对非肿瘤 HK-2 细胞的影响
与 Fermented PDB 类似，Gad 菌丝体提取物在 1000 μg/ml 的高浓度下也对 HK-2 细胞产生强烈毒性（72小时后仅剩3%活力），其半数抑制浓度 (IC50) 为 949 μg/ml。但在 500 μg/ml 及以下浓度时，HK-2 细胞活力未受显著影响，显微镜下细胞密度与对照组相当，这表明在低于 500 μg/ml 的浓度下，提取物对正常肾细胞相对安全。
3.3. Gad 菌丝体乙醇提取物对肾 Caki-1 转移细胞系的影响
有趣的是，Gad 菌丝体提取物对转移性 Caki-1 细胞表现出一种“倒U型”的剂量反应关系：中低浓度（125 和 250 μg/ml）在48和72小时能引起轻微的但统计学显著的活力下降（约14%），但更高浓度（500 和 1000 μg/ml）反而无效。这提示可能存在 hormetic-like（毒物兴奋效应）反应。
3.4. Gad 菌丝体乙醇提取物对原发性肿瘤来源的 786-O 和 RCC-Shaw 肾细胞系表现出剂量依赖性影响
与此相反，提取物对两种原发性肾癌细胞系 786-O 和 RCC-Shaw 则表现出明确且强烈的剂量和时间依赖性抗增殖作用。处理72小时后，在 125–500 μg/ml 浓度范围内，细胞活力显著下降。计算出的 IC50值分别为 333.03 μg/ml (786-O) 和 154 μg/ml (RCC-Shaw)，显示出对 RCC-Shaw 细胞更强的敏感性。光学显微镜观察也证实了浓度依赖性的细胞死亡增加。
3.5. Gad 菌丝体乙醇提取物通过激活凋亡诱导原发性肿瘤来源的细胞死亡
为了阐明细胞死亡的机制，研究人员进行了系列检测。Annexin V/PI 双染显示，经 250 和 500 μg/ml Gad 菌丝体提取物处理24小时后，786-O 和 RCC-Shaw 细胞中 Annexin V 和 PI 的荧光信号呈浓度依赖性增强，表明细胞发生了凋亡。Caspase 3/7 活性检测显示，处理组细胞核内出现明亮的绿色荧光斑点，表明 Caspase 3/7 被强烈激活。Western Blot 分析进一步提供了分子证据：与对照组相比，处理组细胞中抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达降低，而促凋亡蛋白 Bax 和凋亡标志蛋白 cleaved-PARP1 的表达显著升高。这些结果共同证明，Gad 菌丝体提取物是通过激活内在凋亡途径来诱导肾癌细胞死亡的。
3.6. 基于 NMR 的 Ganoderma adspersum 乙醇提取物代谢谱分析
NMR 代谢组学分析揭示了 Gad 菌丝体提取物与 Fermented PDB 提取物在成分上的显著差异。在菌丝体提取物中，琥珀酸、丙氨酸、酪氨酸、鸟苷和腺苷等代谢物显著富集，而发酵液提取物中葡萄糖含量更高。
3.7. 选定单个分子对原发性肿瘤来源的 RCC-Shaw 细胞活力的影响
基于 NMR 结果，研究人员测试了富集的三种代表性单体化合物对 RCC-Shaw 细胞的作用。发现琥珀酸和丙氨酸在测试浓度范围内对细胞活力无影响。然而，腺苷在 25–100 μM 浓度下能剂量依赖性地显著降低 RCC-Shaw 细胞活力，其效果与 Gad 菌丝体提取物相似，提示腺苷可能是提取物中起关键作用的活性成分之一。
3.8. 腺苷 A3受体在介导 Gad 菌丝体提取物效应中的可能作用
既往文献报道腺苷可通过激活腺苷 A3受体 (ADORA3) 诱导肾癌细胞凋亡。本研究通过数据库分析发现，ADORA3 在肾透明细胞癌中的表达量是癌旁正常组织的三倍。为了验证该受体是否介导了提取物的效应，研究人员使用了 ADORA3 的特异性拮抗剂 MRS 1523 和激动剂 2-Cl-IB-MECA。结果显示，激动剂 2-Cl-IB-MECA 能模拟提取物，诱导 RCC-Shaw 细胞活力下降。更重要的是，预孵育拮抗剂 MRS 1523 能显著减弱 Gad 菌丝体提取物（500 μg/ml）所引发的 Caspase 3/7 激活和细胞毒性，对细胞起到保护作用。这强有力地表明，Gad 菌丝体提取物中的腺苷成分，很可能是通过激活在肾癌细胞中过度表达的 ADORA3 受体，从而触发凋亡信号通路，实现对肿瘤细胞的选择性杀伤。
归纳研究结论和讨论部分
本研究首次系统评估了 Ganoderma adspersum 菌丝体乙醇提取物对人肾癌细胞的抗增殖活性，并深入探讨了其潜在机制。核心结论在于：G. adspersum 的菌丝体提取物（而非发酵液提取物）在 125–500 μg/ml 的浓度范围内，能选择性地、剂量依赖性地抑制原发性人肾癌细胞（786-O 和 RCC-Shaw）的增殖，并诱导其发生凋亡，而对非肿瘤肾细胞（HK-2）在同等浓度下相对安全，显示出良好的选择性指数 (Selectivity Index)。尽管其 IC50值未达到美国国家癌症研究所 (NCI) 对粗提物的高标准活性阈值，但其明确的活性趋势和选择性使其成为进一步分离活性成分的优良起点。
机制探究方面，研究通过 NMR 代谢组学锁定了菌丝体提取物中富集的差异代谢物，并功能验证指出腺苷是其中关键的活性化合物。进一步的受体药理实验表明，提取物及腺苷的抗增殖和促凋亡效应，很可能是通过激活在肾癌细胞中高表达的腺苷 A3受体 (ADORA3) 来介导的。这一发现将一种天然产物的活性与一个特定的、在癌症中异常表达的分子靶点联系起来，为理解其作用机制提供了清晰的线索。
综上所述，这项研究的意义在于：1) 拓展了药用真菌 G. adspersum 的抗癌谱，首次揭示了其对肾细胞癌的潜在治疗价值；2) 明确了其菌丝体提取物具有肿瘤选择性，为开发低毒性的天然抗癌剂提供了依据；3) 初步阐明了以腺苷-ADORA3 轴为核心的作用机制，为后续的活性成分定向分离、结构优化及深入机理研究指明了方向。这项研究不仅为肾癌治疗提供了新的候选天然来源，也为将 G. adspersum 开发为功能性食品或药物辅助剂奠定了重要的科学基础。未来的研究应聚焦于从该复杂提取物中生物活性导向分离出更高效的单体或组合成分，并在更复杂的体内模型中验证其疗效与安全性。
