《Journal of Controlled Release》：Bone-targeting β-cyclodextrin phosphate has anti-resorptive activity and thereby prevents osteoporosis
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骨质疏松症（Osteoporosis）是一种以骨量减少和骨微结构恶化为特征的疾病，现有长期疗法存在不良反应风险。为解决此问题，本研究开发了具有磷酸基修饰的β-环糊精（β-CDP），它兼具对羟基磷灰石（HA）的强亲和力以及对胆固醇的增溶能力。研究人员证实，β-CDP能在体外强力结合于骨矿表面，并在体内实现骨骼靶向递送。更重要的是，被HA表面固定的β-CDP可显著抑制破骨细胞的骨吸收功能，而不影响其分化。机制上，β-CDP减少了破骨细胞脂筏中成熟V-ATPase质子泵亚基TCIRG1的分布。在小鼠卵巢切除（OVX）模型和自然衰老模型中，系统性给予β-CDP能有效预防骨丢失和骨小梁结构恶化。该研究为骨质疏松等溶骨性疾病的靶向治疗提供了一个兼具药物递送平台和固有抗吸收活性的新策略。
骨质疏松症是影响全球数亿人健康的“寂静的流行病”。我们的骨骼看似坚固，实则是一个持续进行着“拆旧建新”的动态工厂——由破骨细胞负责吸收老旧骨质，成骨细胞负责生成新骨。在健康的年轻人中，这一“骨重塑”过程维持着微妙的平衡。然而，随着年龄增长，尤其是女性绝经后雌激素水平下降，破骨细胞的“拆旧”活动会异常活跃，超过了成骨细胞的“建新”能力，导致骨量流失、骨微结构变得脆弱，这便是骨质疏松症的典型特征。这种“入不敷出”的失衡使得骨骼像被蛀空的大厦，轻微碰撞甚至日常活动都可能引发骨折，严重影响生活质量和寿命。
目前，抑制破骨细胞功能的抗骨吸收药物是治疗骨质疏松症的基石，其中最经典的是双膦酸盐类药物。这类药物好比精准制导的“导弹”，能通过其磷酸基团牢固地“粘”在骨骼的主要矿物成分——羟基磷灰石（HA）上，并被活跃的破骨细胞吞入，从而抑制其功能、诱导其凋亡。尽管疗效显著，但双膦酸盐与骨骼的结合几乎是“永久性”的，长期使用后会在骨骼中持续累积，潜在地带来一些罕见的严重副作用，如非典型股骨骨折和药物相关的颌骨坏死。这就像在骨骼里埋下了“长眠的地雷”，虽然短期内阻止了破坏，但长远的未知风险让医生和患者，尤其是年轻患者，在使用时顾虑重重。因此，开发一种既能有效抑制骨吸收，又能在骨骼中“可进可出”、减少长期滞留风险的新型疗法，成为了骨质疏松治疗领域亟待解决的难题。
近日，一项发表在《Journal of Controlled Release》上的研究带来了一个令人兴奋的“两用型”新武器。来自大阪齿科大学的研究团队巧妙地改造了我们熟悉的一种化合物——β-环糊精（β-CD）。β-CD是一种环状寡糖，其结构像一个中间疏水、外围亲水的“空心甜甜圈”，常被用作药物载体来包裹和递送疏水性分子。研究人员给它的分子外围装上了多个磷酸基团，合成了磷酸化β-环糊精（β-CDP）。这一改造赋予了它双重“天赋”：其一，磷酸基团使其能像双膦酸盐一样，与骨骼中的羟基磷灰石（HA）强力结合，实现骨骼靶向；其二，保留的环糊精空腔结构使其能有效“抓住”并增溶胆固醇。而胆固醇是构成细胞膜上关键信号平台——“脂筏”的主要成分，对于破骨细胞形成高效的“褶皱缘”结构（用于分泌酸和酶来溶解骨质）至关重要。研究人员设想，β-CDP或许能先“锚定”在骨表面，再利用其胆固醇提取能力，精准地干扰破骨细胞行使功能的“工具箱”，从而在不杀死细胞的情况下“缴械”其破坏能力。这篇题为“Bone-targeting β-cyclodextrin phosphate has anti-resorptive activity and thereby prevents osteoporosis”的论文，系统地验证了这一假说，为骨质疏松的靶向治疗提供了全新的平台策略。
为了开展这项研究，研究人员综合运用了分子与细胞生物学、动物模型及影像学等多种关键技术。在结合特性验证方面，他们使用了荧光标记结合与解离实验，在模拟骨骼的羟基磷灰石（HA）涂层板上评估β-CDP的吸附与解离动力学，并利用活体光学成像系统（IVIS Spectrum CT）在小鼠模型中直观观测其骨骼靶向和药物（吲哚菁绿，ICG）递送能力。在细胞功能研究中，他们采用经典的破骨细胞前体细胞系RAW264.7，通过核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导其分化为破骨细胞，利用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色计数多核破骨细胞，并在HA板上进行“骨陷窝形成实验”来量化骨吸收活性。在机制探索层面，他们进行了去污剂抗性膜（DRM）组分分离及免疫印迹实验，以分析关键蛋白V-ATPase a3亚基（TCIRG1）在脂筏中的分布变化。在体内药效评价中，他们建立了两种小鼠模型：通过手术切除卵巢（OVX）构建的绝经后骨质疏松模型，以及利用自然衰老的4月龄小鼠构建的增龄性骨丢失模型，并通过显微计算机断层扫描（μCT）对股骨远端进行高分辨率三维成像和骨微结构参数分析，以评估β-CDP的长期预防效果。
研究结果
3.1. β-CDP强烈结合于HA表面
研究人员发现，荧光标记的β-CDP在体外能与HA涂层板发生剂量依赖性的强力结合，其结合在生理盐分浓度（如PBS、细胞培养基、高浓度NaCl）环境下极为稳定，难以被洗脱，但可被钙螯合剂EDTA完全解离。这表明β-CDP通过磷酸基团与HA中的钙离子形成了稳定、特异且可逆（在EDTA作用下）的相互作用，为其骨骼靶向奠定了分子基础。
3.2. β-CDP具备骨靶向药物递送能力
体内分布实验显示，皮下注射荧光标记的β-CDP后30分钟，荧光信号便特异性富集在小鼠的颅骨、股骨、胫骨等骨骼部位，并在24小时内持续存在，至48小时基本消退，显示出快速靶向和相对较短的骨骼滞留特性。更关键的是，当将疏水性的模型药物吲哚菁绿（ICG）用β-CDP包裹后注射，ICG也能被成功递送至骨骼；而游离的ICG则只会在肝脏积累。这证明了β-CDP不仅能自身靶向骨骼，还能作为载体将其他药物精准送达骨组织。
3.3. β-CDP具有胆固醇增溶活性
通过高效液相色谱（HPLC）分析证实，β-CDP能显著增加胆固醇在水溶液中的溶解度。这验证了其环糊精核心结构保留了提取胆固醇的能力，这是其可能干扰依赖胆固醇的细胞膜功能（如脂筏）的前提。
3.4. β-CDP对RAW264.7细胞无细胞毒性作用
无论是在培养基中直接添加（游离状态），还是预先包被在HA板上（固定状态），β-CDP在高达1000 μM的浓度下均未对破骨细胞前体细胞RAW264.7的活力产生显著影响。相比之下，作为阳性对照的双膦酸盐类药物阿仑膦酸钠（ALN）在高浓度（1000 μM）时表现出明显的细胞毒性。
3.5. β-CDP不影响破骨细胞分化
TRAP染色和破骨细胞特异性基因（Nfatc1、Ctsk、Calcr）表达分析表明，无论是游离还是固定形式的β-CDP，均不抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和成熟。而阿仑膦酸钠（ALN）则显著减少了破骨细胞的数量。这说明β-CDP的作用模式与直接抑制细胞分化的传统药物不同。
3.6. β-CDP在体外抑制破骨细胞性骨吸收
关键的“骨陷窝形成实验”结果显示，被HA表面固定的β-CDP（浓度≥10 μM）能显著减少破骨细胞在HA板上形成的吸收陷窝面积，其抑制效果与固定形式的阿仑膦酸钠（ALN，≥100 μM）相当。值得注意的是，仅需在细胞培养早期（第0-3天）给予β-CDP处理24小时，就足以产生显著的抗吸收效果，而到第4天处理则无效。这表明β-CDP主要作用于破骨细胞功能建立的早期阶段，而非成熟的吸收过程本身。
3.7. β-CDP减少成熟糖基化V-ATPase a3亚基在去污剂抗性膜（DRM）脂筏组分中的分布
机制研究发现，β-CDP处理显著降低了破骨细胞中去污剂抗性膜（DRM，富含脂筏）组分中成熟糖基化形式的V-ATPase a3亚基（TCIRG1）蛋白水平，而对脂筏标志蛋白Flotillin-1的分布无影响。V-ATPase是破骨细胞在褶皱缘分泌质子、酸化骨吸收微环境的关键质子泵。这一结果提示，β-CDP可能通过干扰胆固醇环境，特异性地破坏了V-ATPase在破骨细胞吸收功能关键部位——脂筏中的正确定位和稳定，从而削弱其酸化能力。
3.8. 系统性β-CDP给药可预防卵巢切除（OVX）小鼠的骨丢失
在模拟绝经后骨质疏松的卵巢切除（OVX）小鼠模型中，每周两次皮下注射β-CDP（500 mg/kg）持续5周，能完全防止OVX引起的骨小梁丢失。显微CT（μCT）分析显示，β-CDP治疗组小鼠的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和数量（Tb.N）等参数均恢复到与假手术组相似的水平，有效防止了骨小梁结构的恶化。同时，血清肝酶（ALT、AST）和肌酐水平正常，表明在该剂量下未引起明显的肝肾功能损伤。
3.9. 长期β-CDP给药可预防增龄性骨丢失
在自然衰老的4月龄小鼠中，每周一次给予较低剂量（100 mg/kg）的β-CDP，持续4个月，同样能显著增加股骨远端的骨小梁骨量（主要是通过增加骨小梁厚度），有效延缓了与年龄相关的骨丢失进程。长期给药后，小鼠的肝肾功能指标依然保持正常，且体外溶血实验证实β-CDP在很宽浓度范围内对红细胞几乎没有破坏作用，进一步支持了其良好的生物相容性。
结论与讨论
本研究成功开发并验证了磷酸化β-环糊精（β-CDP）作为一种新型骨骼靶向纳米药物载体的双重价值：它本身即是一种具有抗骨吸收活性的治疗剂，同时也是一个高效的骨靶向递送平台。其创新性主要体现在以下几个方面：
首先，“靶向锚定”与“功能干扰”的结合。β-CDP通过磷酸基团实现与骨矿物HA的强力、可逆结合，能精准富集于骨表面，尤其是骨重塑活跃的区域。一旦定位，其环糊精空腔可提取局部胆固醇，特异性地干扰破骨细胞褶皱缘处脂筏的完整性，从而阻碍V-ATPase质子泵的正确装配和功能，最终抑制骨吸收。这种“先定位，后干扰”的机制，使其能在不杀死或抑制破骨细胞分化的前提下，选择性地“缴械”其破坏功能，这有别于大多数现有药物，可能有助于维持更生理性的骨重塑偶联。
其次，“可逆滞留”带来的潜在安全性优势。与几乎永久性结合于骨骼的双膦酸盐相比，β-CDP在骨骼中的滞留时间相对较短（约48小时），这种“可进可出”的特性有望大幅降低药物在骨骼中长期累积所带来的罕见但严重副作用（如颌骨坏死、非典型骨折）的风险，为需要长期或间歇治疗的患者提供了更灵活、更安全的选择。
最后，“一材多用”的平台拓展潜力。β-CDP的环糊精空腔为封装各类疏水性治疗药物（如抗炎药、促成骨剂、抗生素甚至抗癌药）提供了可能，使其能作为一个通用平台，将多种药物精准递送至骨骼病灶，用于治疗骨质疏松、骨关节炎、骨髓炎、骨肿瘤等多种骨骼疾病。
总之，这项研究不仅为骨质疏松症的治疗提供了一种颇具前景的新候选药物，更重要的是展示了一个集“靶向、治疗、递送”于一体的智能化分子设计范例。β-CDP的成功，标志着骨靶向治疗从单纯的“药物运送卡车”向自带“维修或防御功能”的“智能工程车”迈进了一步，为未来应对复杂的骨骼疾病挑战开辟了新的思路。
