《NMR in Biomedicine》：1H NMR Chemical Shifts and J-Coupling Constants Dependence on Temperature and pH: Implications for the Quantification of Relevant Metabolites
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本综述深入探讨了温度与pH变化对15种关键代谢物1H核磁共振（NMR）化学位移与J耦合常数的影响，旨在为（MRS）数据的精确量化提供优化模型。研究通过体外测量与数据建模，建立了预测模型函数，并模拟分析了在生理与病理温度、pH变化下，使用不准确先验知识对代谢物浓度定量（特别是对脑能量代谢至关重要的总肌酸（tCr）及谷氨酸/谷氨酰胺）造成的误差，强调了在（MRS）分析中纳入这些环境参数校正的重要性，以避免或最小化量化误差。
1 引言
质子核磁共振波谱（1H MRS）是一种能够在体外和体内非侵入性测量生物系统中多种化合物的强大技术，为研究正常与病理状态下的特征性代谢过程和识别生物标志物提供了可能。因此，对重要化合物的可靠量化至关重要。为此建立的许多量化方法（如LCModel、QUEST、AQSES、TARQUIN）都使用基于化学位移和J耦合常数先验知识的模型谱。然而，1H MRS的广泛应用范围使其能够基于模型生物的生理条件在不同温度和pH值下使用。例如，在人类和啮齿类动物的体内研究中，体温通常约为37°C，但发热或麻醉可显著影响体温。此外，在比较生理学研究中，鱼类、两栖类等变温动物的体温可随环境温度在冰点至40°C以上大幅波动。另一个关键生理因素是pH值，它在细胞功能中扮演核心角色，其变化是许多病理和疾病进程的重要标志。先前的研究已调查了部分脑代谢化合物1H化学位移的温度依赖性，以及某些信号在低场区域的pH依赖性，但缺乏对化学位移和J耦合常数在宽温度与pH范围内联合效应的系统性研究。因此，本研究旨在填补这一空白，为优化1H MRS数据的量化提供关键先验知识。
2 实验
2.1 脉冲序列参数
1H NMR测量在9.4 T宽腔核磁共振谱仪上进行，使用标准单脉冲序列。样品温度通过谱仪集成冷却系统调节为40°C、30°C、20°C、10°C和1°C。
2.2 代谢物溶液
制备了五组代谢物溶液，每组包含3-4种化合物（各10 mM），溶解于含90%蒸馏水和10% D2O的磷酸盐缓冲盐水中，并添加DSS作为化学位移内标。将溶液滴定至pH 5.5-8.0之间的六个值。分组原则是避免组内代谢物信号在谱图中重叠。
2.3 数据处理与拟合
使用MestReNova软件进行谱图处理，并通过全局谱去卷积（GSD）算法自动确定化学位移和J耦合常数。对于具有复杂多重峰结构的谷氨酸（Glu）和谷氨酰胺（Gln），则使用基于GAMMA NMR库的自定义程序进行优化拟合。
2.4 数据建模
化学位移和J耦合常数的pH依赖性用修正的Henderson–Hasselbalch方程形式的S型函数描述。由于化学位移的温度依赖性在0°C–40°C范围内不能假设为线性，因此采用了二阶多项式。
2.5 模拟与量化
使用jMRUI软件包，以本研究在37°C、pH 7.0下测定的化学位移和J耦合常数作为先验知识，模拟了15种代谢物的谱图。通过应用前述模型函数，调整参数以对应不同温度（32°C、35°C、37°C、40°C）和pH（6.5、7.2、7.7）组合。模拟的代谢物浓度设定为模拟大鼠脑内典型水平，并使用AQSES算法对模拟谱图进行量化分析，以评估使用不准确先验知识（即以37°C、pH 7.0的参数去量化不同条件谱图）带来的误差。
3 结果
3.1 脑代谢物的温度与pH依赖性化学位移
研究系统展示了15种代谢物的化学位移和J耦合常数随温度和pH的变化。为清晰呈现，结果部分为每种化合物展示了两个表现出最显著温度或pH依赖性变化的信号，所有共振的完整概述、示例谱图和模型函数参数可在补充材料中找到。
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N-乙酰天冬氨酸（NAA）：其甲基基团（2.01 ppm）的化学位移在整个温度和pH范围内几乎恒定。相比之下，3CH2基团表现出几乎线性的随温度漂移，而3'CH2基团则显示出pH依赖性。酰胺NH基团的信号线形随温度变化显著，从清晰的双峰变为宽单峰。
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丙氨酸（Ala）：其3CH3和2CH基团的化学位移均不随pH变化，但2CH基团随温度升高有轻微的低场漂移。
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γ-氨基丁酸（GABA）：4CH2基团的化学位移表现出强烈的温度依赖性，随温度升高向低场漂移，而2CH2基团则显示出轻微的pH依赖性。
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天冬氨酸（Asp）：3'CH2基团的化学位移随温度升高向上场漂移，其J耦合常数也显示出温度依赖性。
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胆碱（Cho）：N(CH3)3和2CH2基团的化学位移表现出非常相似的随温度升高向上场漂移的趋势，但与pH无关。
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肌酸（Cr）：所有质子基团的化学位移均表现出温度依赖性漂移，但方向相反。N(CH3)基团随温度升高向低场漂移，而2CH2和NH基团则向上场漂移。NH共振的线形也随pH变化。
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谷氨酸（Glu）：所有共振的化学位移均表现出温度依赖性，且信号随温度升高向相反方向漂移（2CH和3CH2向上场，3'CH2、4CH2和4'CH2向低场），并观察到信号线形随温度变化而变锐。
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谷氨酰胺（Gln）：2CH和3'CH2质子基团的化学位移主要表现出pH依赖性，而3CH2、4CH2和4'CH2质子基团则随温度升高向低场漂移。两个NH2基团的共振随温度升高向上场漂移，且线形随温度变化。
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甘氨酸（Gly）：其单峰信号仅显示出轻微的pH和温度依赖性化学位移变化，但线形随温度降低而变宽。
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组氨酸（His）：所有共振均显示出不同的pH依赖性（信号向上场漂移），而温度依赖性可忽略不计。线形和J耦合常数也观察到变化。
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肌醇（m-Ins）：2CH、4,6CH和5CH质子基团表现出几乎相同的行为，即化学位移随温度升高向水信号方向（低场）漂移，并随酸性增加有类似变化。
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乳酸（Lac）：甲基和次甲基基团的化学位移均表现出轻微的随温度升高向远离水信号方向（低场）漂移的趋势，且信号线形随温度升高变窄。
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磷酸肌酸（PCr）：两个高场信号的化学位移差随温度升高而减小，且两者在酸性pH范围内化学位移均轻微降低。两个NH质子的共振随温度升高向水信号方向漂移，且线形变化显著。
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牛磺酸（Tau）：两个三重峰的化学位移均表现出轻微的温度依赖性和更强的pH依赖性，即在酸性pH下两者不均一地移向水信号。
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苏氨酸（Thr）：2CH基团双峰的化学位移显示出轻微的温度依赖性和更强的pH依赖性，而3CH和4CH3基团的这种依赖性减弱。
在分析的15种代谢物中，有10种表现出显著的温度依赖性，仅有3种在化学位移的pH依赖性方面表现出显著变化。Gln和NAA在温度和pH上均表现出显著依赖性，尽管不同质子基团的敏感性不同。
3.2 从模拟数据集中量化不同温度和pH下的脑代谢物
模拟了包含15种代谢物、具有典型大鼠脑内浓度的1H NMR谱图。使用AQSES算法，以37°C、pH 7.0的化学位移值作为先验知识，对不同温度和pH组合下模拟的谱图进行量化分析。
结果表明，对于在37°C、pH 7.2下模拟的数据集，使用37°C、pH 7.0的先验知识，大多数代谢物浓度的最大偏差在1.5%以内。然而，当温度和pH偏离参考条件时，量化误差显著增加：
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pH影响：在pH 6.5 (37°C) 下，平均偏差约为2%，甘氨酸（Gly）和组氨酸（His）偏差最大。在pH 7.7 (37°C) 下，平均偏差升至8%（His除外），苏氨酸（Thr）和胆碱（Cho）被显著低估。
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温度影响：降低温度至32°C (pH 7.2) 导致平均偏差达15%（His除外），其中肌酸（Cr）被低估44%，磷酸肌酸（PCr）被高估44%。升高温度至40°C导致平均偏差为11%，Cr被高估39%，PCr被低估34%。
3.3 从模拟数据集中量化不同温度和pH下的tCr和Glx
重点分析了与细胞能量状态及多种神经精神疾病密切相关的总肌酸（tCr）以及谷氨酸（Glu）和谷氨酰胺（Gln）之和（Glx）的量化情况。
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tCr (Cr + PCr)：在不同温度和pH下，Cr和PCr的单独浓度估算值偏差巨大且趋势相反（例如40°C时Cr高估39%、PCr低估34%）。然而，两者的和信号tCr在所有温度和pH值下仅显示出微小偏差，最大高估约2%。
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Glx (Glu + Gln)：在所有温度以及pH 7.2和6.5下，Gln和Glu的浓度偏差最大为4%，且Glx信号的偏差可忽略不计。在pH 7.7时，Gln浓度在高温下被高估达12%，Glu表现出相反趋势，但Glx信号的偏差仍然可忽略。
4 讨论
本研究系统调查了15种重要代谢化合物1H化学位移和J耦合常数的温度和pH依赖性，并建立了预测模型函数。与使用TSP不同，本研究所有化学位移均参考了在D2O中pH和温度依赖性极小的DSS，确保了参照的稳定性。测定值的标准偏差与文献报道相当。
与既往研究对比，例如NAA的NH基团化学位移随温度的线性变化斜率与文献值接近，微小差异可能源于参照信号（本研究用DSS，文献用温度依赖的Cr的N(CH3)共振）以及溶液成分（如离子强度、蛋白质浓度）的不同。重要的是，对于量化而言，代寫物内不同共振间化学位移的差异比绝对化学位移值更为关键。
研究发现，牛磺酸（Tau）三重峰化学位移的强pH依赖性，为利用其确定细胞内pH值提供了潜力。在量化误差方面，温度变化对绝对浓度定量的影响比pH变化更为显著，特别是在较低温度下。有趣的是，尽管NAA和Gln的信号化学位移随pH变化显著，但其绝对量化误差却很小或可忽略。相反，Cho、Gly、Thr和His等代谢物尽管化学位移随pH变化不显著，但由于其低浓度或与其他代谢物信号（如m-Ins）重叠，在pH变化时量化误差较大。
对于体内代谢物定量，通常使用内部参照信号，如NAA的甲基共振（2.01 ppm）或Cr的甲基质子共振（3.03 ppm）。尽管Cr峰在多种情况下相对稳定，但在肿瘤和中风等病理状态下其水平会发生变化，使用时需注意。此外，在利用模拟模型函数时，需注意自旋-晶格和自旋-自旋弛豫时间（T1和T2）也具有温度依赖性，尽管在使用长重复时间和短回波时间的脉冲序列时可最小化其影响。
本研究强调了在生理因素如pH和温度发生变化（例如在病理生理条件下）时，为确保体内1H MRS数据量化准确，使用正确的先验知识的必要性。
5 结论
本研究详细汇编了15种重要代谢化合物的1H化学位移和J耦合常数，并对其pH和温度依赖性进行了建模。研究结果可极大补充创建正确的模型函数所需的先验知识，用于体内1H MRS数据的量化。因此，本工作有助于避免或最小化由不正确先验知识引起的量化误差，特别是在由于生理条件、模型生物或实验条件导致pH或温度变化或波动的情况下。
