《NMR in Biomedicine》：Noninvasive 11.7-T Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging Reveals Retinal Metabolic Alterations Induced by Blue Light Exposure
文章内容归纳总结
摘要
作为中枢神经系统的一部分，视网膜是人体代谢最活跃的组织之一，对光敏感，尤其是过度暴露于蓝光（400–500 nm）易通过氧化反应导致退行性变，这一机制与年龄相关性黄斑变性（AMD）或糖尿病视网膜病变有关。本研究旨在应用氧化应激动物模型，使用11.7-T 1H-磁共振波谱（1H-MRS）监测代谢变化。将成年大鼠暴露于高强度蓝光（440 nm，6000 lx），并研究暴露后长达48小时的视网膜代谢变化。所获谱图突显了数种关键视网膜代谢物的存在，包括脂质（烷基链CH2）、乳酸、N-乙酰天冬氨酸（NAA）、谷氨酸（Glu）、胆碱（Cho）、牛磺酸（Tau）、肌酸（Cre）和葡萄糖（Glc）。蓝光诱导了与氧化应激相关的特异性变化，1H-MRS使我们能够追踪暴露后的动态代谢变化。这是首次在不牺牲动物的情况下进行的视网膜组织活体波谱研究。为验证活体代谢物归属，对未暴露于蓝光的单独动物的眼球进行了局部离体1H-MRS。
1 引言
视网膜是对光最敏感的结构之一，过度暴露于蓝光被认为是产生氧化应激和代谢改变的原因。衰老的视网膜尤其易受此类改变影响，导致视网膜变性加速。几乎所有65岁以上的人都会出现视网膜下细胞外脂质和蛋白质积累，伴随炎症和补体激活，在许多情况下会发展为威胁视力的疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）。氧化应激与炎症的关联不仅限于AMD；许多其他眼部疾病在其发病链中也有此联系：糖尿病视网膜病变、视网膜营养不良，甚至白内障。
AMD是老年人视力丧失的主要原因。它是一种多因素疾病，涉及遗传和环境因素。只有在疾病产生显著的视网膜改变后，才能使用特定的眼科工具（如光学相干断层扫描）研究AMD。用于早期检测这些视网膜变化的非侵入性功能/代谢方法尚不充分。电生理学研究允许间接评估视网膜的功能变化，显示光暴露后a波和b波的减少。动物模型中的视网膜变化通常只能通过侵入性方法评估，特别是组织学和免疫组织化学，这意味着牺牲动物。代谢和功能变化之间存在联系，从尽可能早的阶段探索这种联系将有助于更好地理解AMD。
模拟人类视网膜疾病的动物视网膜变性模型是众所周知的，尤其是在啮齿动物中。啮齿动物视网膜缺乏真正的黄斑，但涉及视网膜功能的过程与人类非常相似。变性模型包括氧化应激模型（超氧化物歧化酶敲除变体和香烟烟雾/氢醌暴露）、炎症模型（补体因子H敲除和过表达C3的转基因小鼠）、多基因变异、链脲佐菌素（诱导高血糖）、激光诱导新生血管形成或光毒性模型。光毒性模型中使用不同的光源，导致不同的暴露波长（通常是白光或蓝光）和各种光强度（低至150 lx）。活体研究充分记录了视网膜暴露于蓝光（发光二极管LED光源）的后果。在高强度下，预计早期会出现代谢变化，随后出现视网膜变薄，尤其影响光感受器层和视网膜色素上皮（RPE）。
磁共振成像（MRI）是一种非侵入性模态，可以很好地呈现活体结构的解剖和功能。在评估视网膜时，常规MRI的局限性不允许完全研究这一约200 μm厚的神经层，也不允许研究生理或氧化应激后发生的代谢变化。在大鼠中，一半的视网膜厚度由光感受器占据，包括胞体（外核层）和外段。MRI与波谱的结合将允许分析视网膜的化学成分，前提是MRI的低空间分辨率可以得到改善。磁共振波谱（MRS）已用于分析其他器官，包括人类和动物：通常是大脑，但也包括心脏、骨骼肌或肝脏。质子MRS（1H-磁共振波谱[1H-MRS]）是主要的采集方式。
1.1 研究目的
成年大鼠眼睛急性暴露于蓝光会诱导代谢变化，迄今为止这些变化仅通过需要牺牲动物的侵入性方法进行研究。我们的假设是，这些变化可以使用1H-MRS检测，这是一种非侵入性技术，不需要牺牲实验动物。由于没有已发表的关于大鼠视网膜局部MRS的参考文献，还对未暴露于蓝光的单独动物的眼球进行了局部离体1H-MRS实验，以验证活体获得的代谢物归属。
2 材料与方法
2.1 动物模型
使用平均体重约220 g的雄性Wistar大鼠。所有实验程序均根据关于保护用于科学目的动物的2010/63/EU指令和适用的国家立法进行。研究方案获得了国家兽医和食品安全局（ANSVSA）的批准。在蓝光暴露和MRI数据采集期间，用1.5%–2.5%的异氟烷麻醉大鼠。
2.2 蓝光暴露装置
用于将动物暴露于蓝光的系统由两个独立的电源组成。主电源用于调节波长为440 nm（±3%）的UV-LED矩阵的强度。二次电源用于热管理子系统。系统允许控制蓝光照15分钟。在每次暴露前，在管子末端（动物头部放置处）用照度计验证光强度，确认剂量为6000 lx。
2.3 1H-MRS采集
MRI实验使用Bruker BioSpec 11.7-T系统进行。使用PRESS 1H-MRS协议，重复时间（TR）= 1800 ms，回波时间（TE）= 16.5 ms。感兴趣体素尺寸为0.98 × 4.68 × 4.87 mm。应用VAPOR 1协议抑制感兴趣区域（ROI）的水信号。
2.4 MATLAB处理与分析
使用自定义MATLAB脚本进行时间微分谱分析，评估视网膜随时间的代谢变化。该方法涉及将频率转换为化学单位（ppm）以及随时间变化的连续谱图的三维表示。计算连续谱图之间的点差异，以隔离可能指示特定代谢物出现或消失的显著信号变化。此外，手动选择代表性谱图中的代谢物峰，并使用水信号作为参考进行归一化。然后跟踪归一化强度随时间的变化，生成每种代谢物的动力学曲线。
2.5 使用Java磁共振用户界面（jMRUI）模拟代谢物
使用jMRUI软件中的AMARES模块（非线性最小二乘[NLLS]量化算法）处理和去卷积在活体大鼠眼中观察到的广泛重叠信号，以识别和量化贡献于MR信号的代谢成分。
2.6 离体MRS研究
对于离体实验，牺牲单独的动物，取出眼球并保留至少1厘米的视神经以便定向。然后将眼球安装在装有蒸馏水的Eppendorf管中。使用上述相同方法进行1H-MRS采集。
3 结果
3.1 暴露前不同受试者的1H谱图：个体间重现性评估
对暴露前大鼠记录的谱图进行比较以评估重现性。个体间信号稳定，仅乳酸和Glu代谢物峰存在轻微变异。使用组织水信号强度作为内部参考进行标准化。大鼠视网膜组织的1H-MRS谱图显示出宽峰，这是由于组织的半固体性质及其高含水量影响了局部磁场环境。
3.2 暴露前后的1H谱图
将相同的MATLAB脚本应用于动物暴露于蓝光后10分钟采集的谱图。随后在80分钟内以10分钟的规则间隔重复谱图采集，以评估潜在的即时代谢变化。未观察到显著的急性代谢改变。为研究延迟代谢效应，在暴露后24和48小时重复实验。在暴露后48小时观察到延迟代谢效应，表明某些生化改变需要更长的时间间隔才能被MR波谱检测到。
处理后的八个1H-NMR谱图揭示了清晰的代谢改变。脂质信号（1.03 ppm）增加，乳酸（1.14 ppm）显著升高，表明无氧代谢增强。NAA（1.87 ppm）显示急剧且持续的减少，提示神经元完整性受损。Glu（2.3 ppm）显示初始下降后增加，反映了双相代谢反应。对于胆碱（Cho）（3.21 ppm）、牛磺酸（3.40 ppm）和Cre（3.81 ppm），未观察到显著变化。葡萄糖（5.35 ppm）显示下降后部分恢复，表明初始消耗增加。3D谱图和差异分析证实了这些趋势，动力学速率计算允许量化变化。
3.3 用于验证代谢物归属的离体研究
由于缺乏专门描述视网膜组织1H-MRS谱图的参考文献，需要进行离体实验以确认活体中识别的代谢物归属。为此，对未暴露于蓝光的离体大鼠眼球进行了局部离体1H-MRS测量。从大鼠视网膜组织获得的离体1H-MRS谱图由于运动伪影的消除和背景噪声的降低，显示出优于活体谱图的分辨率。这种更高的分辨率允许识别和归属代谢物，包括乳酸、NAA、Cre、Cho、肌醇（mI）和牛磺酸。mI信号在离体中更为突出，可能是由于该化合物从细胞区室释放以及弛豫效应和与其他信号重叠的减少，从而支持并验证了活体中检测到的代谢物归属。化学位移和峰形保持一致，主要差异是定量的而非定性的。
3.4 jMRUI验证
随后，使用jMRUI软件中的AMARES算法处理这些谱图，以模拟并将总信号去卷积为其代谢成分。该模拟能够识别所研究区域中存在的10种主要代谢物。获得的MR谱图突显了几种必需代谢物的存在，包括脂质（特别是烷基链CH2—亚甲基）、乳酸、NAA、Glu、Cho、牛磺酸、Cre、水（H2O）和葡萄糖。Cho和Cre的不同成分未分离，牛磺酸峰与mI重叠。模拟谱图与实验谱图之间的良好对应关系证实了应用于视网膜MR信号的AMARES拟合方法的可靠性。
4 讨论
4.1 生物学解释
1H-MRS能够在活体中识别视网膜代谢物的改变，显示出相对较低的个体间变异性。视网膜环境似乎稳定，仅在乳酸代谢以及较小程度上在Glu代谢中存在轻微变异。这些变异可能由个体对应激的反应和一般代谢（如心率和体温）的变异解释。
视网膜1H-MRS研究面临某些挑战，部分与组织尺寸有关。人和大鼠视网膜厚度仅为200 μm。不幸的是，不可能仅扫描视网膜组织。感兴趣体素还将包含脉络膜、玻璃体和晶状体周边，后两种结构含水量高。然而，我们旨在将检测聚焦于视网膜后极中央区域，靠近视神经。另一方面，蓝光暴露预计会在最具反应性的组织（即视网膜）中产生更强的反应，而周围组织（晶状体、玻璃体和脉络膜）基本保持稳定。代谢物的任何变化可能源于视网膜刺激。
在啮齿动物上获得的1H-MRS谱图允许精确去卷积以识别关键生物分子，并将这些发现与文献中已描述的关于类似组织（特别是大脑）的预期化学位移值进行比较。主要化学位移被归属于脂质、乳酸、NAA、Glu、Cho、牛磺酸、Cre、水和葡萄糖。MRS中的脂质鉴定是指移动的细胞内甘油三酯和胆固醇，在1–1.3 ppm处有一个强峰。在视网膜水平，本研究中在1.03 ppm处观察到的脂质峰主要涉及脂质的烷基链CH2(n)。乳酸在缺氧或脑损伤时升高。NAA是神经元完整性的标志物，是最大的峰，位于约2 ppm处。Glu-Gln复合物（Glx）位于2.1至2.4 ppm之间，在中风和缺氧时发生变化。Cho在3.2 ppm处共振，是星形胶质细胞膜标志物，在脑肿瘤或多发性硬化症中增加。牛磺酸在3.4 ppm处共振，通常在髓母细胞瘤中升高。Cre通常在3 ppm处可见，另一个峰在3.9 ppm处，具有稳定信号，用作MRS的内部参考点。
关于视觉系统，枕叶（特别是V1区）的神经化学研究更深入。先天性盲人群V1的MRS发现Cre、Cho和mI增加，但Glu变化存在变异。偏头痛视觉皮层的MRS研究观察到乳酸的变化（水平升高或无变化）、NAA（通常减少或无变化）以及关于Glu/Glx水平相互矛盾的信息。视觉刺激期间的MRS显示乳酸和葡萄糖增加。
增加MRI的场强可改进检测。高磁场允许增加信噪比（SNR）和化学位移。长TR（在我们的案例中，TR = 1800 ms）可最小化信号衰减。PRESS序列保留了所选ROI中所有可用的磁化。为了抑制不需要的回波，我们的研究中使用了长TE（TE = 16.5 ms）。
视网膜代谢是一种特殊的代谢，涉及生物体中最活跃的细胞之一——光感受器。光感受器是细长的极化细胞，外段富含磷脂膜并专门用于检测光。大多数线粒体位于称为椭圆体带的中央区域。高能量需求与其对光的惊人敏感性（单个光子足以刺激视网膜）和持续的脂质生产有关。光感受器必须迅速对光强度的重大变化（高达九个数量级）做出反应。葡萄糖从脉络膜输送，并通过RPE（由葡萄糖转运蛋白促进）运送到外视网膜。它是光感受器的主要燃料，然后产生并输出乳酸，以通过单羧酸转运蛋白（MCT）支持邻近细胞（Müller胶质细胞和RPE）的氧化代谢。光感受器表现出高比率的有氧糖酵解（类似于癌细胞中的瓦博格效应），即使存在足够的氧气，也能将其消耗的80%–90%的葡萄糖转化为乳酸。这个过程对于产生脂质和核酸至关重要，这些是光感受器外段持续更新以及产生NADPH所必需的，NADPH对于抗氧化防御光诱导的氧化应激至关重要。它还快速生成ATP，尽管效率低于有氧糖酵解。在RPE和Müller细胞内，乳酸被转化回丙酮酸，并通过三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化完全氧化，产生大量ATP以满足其自身的能量需求。视网膜需要糖酵解和氧化磷酸化来启动视觉。
光感受器通过MCT1和MCT4输出乳酸，而RPE则通过MCT3促进光感受器和脉络膜循环之间的双向乳酸交换，从而将外视网膜代谢与全身循环整合。视网膜细胞（光感受器、神经节细胞、RPE和Müller细胞）之间的这种协作相互作用构成了乳酸穿梭，这是视网膜生理学中至关重要的代谢途径，整合了细胞类型之间的能量转移和代谢信号传导。
乳酸升高是代谢功能障碍的生物标志物，也是一种病理介质。它通过激活HIF-1α促进血管生成，通过蛋白质乳酸化调节免疫反应，通过转化生长因子-β产生促纤维化信号传导。过度的乳酸穿梭限制丙酮酸进入线粒体，从而降低TCA循环活性，加剧线粒体应激。
NAA在神经元健康和功能中发挥作用，充当脂质合成的乙酰基储备和线粒体能量生产的间接调节剂。NAA在神经元线粒体中合成，并作为胶质细胞中髓鞘脂质合成和维护所需的乙酰基关键储备。它被运出神经元并进入胶质细胞，在那里被天冬氨酸酰化酶II（ASPA）分解为天冬氨酸和乙酸盐；然后乙酸盐用于脂质合成。视网膜NAA是通过迷你克雷布斯循环产生的，这是一种节能的代谢途径，主要在视网膜光感受器细胞中识别。该循环使细胞能够将糖酵解与线粒体氧化磷酸化解耦。它由回补底物如Gln和支链氨基酸而非葡萄糖提供燃料。
在完整的生物组织如视网膜中，分子运动是各向异性的。这导致NMR谱图中的谱线展宽，使得CH2基团产生分辨率较低、宽的峰包络，而不是尖锐的单峰。视网膜是脊椎动物组织中多不饱和脂肪酸含量最高的组织之一。因此，视网膜富含二十二碳六烯酸（DHA；22:6n-3），它具有六个亚甲基间隔的双键。这种结构施加了特定的构象约束和动力学。DHA中的各种CH2基团在化学上并不完全等价，因为它们相对于双键的位置不同。这导致在化学位移范围内产生多个重叠的CH2信号，而不是一个单一的简单峰。视觉色素漂白的 photoreactive 产物，全反式视黄醛（AtRAL），在光感受器膜中积累并与脂质相互作用。这些相互作用导致双视黄醛缩合产物（如N-视黄基-N-视黄基乙醇胺[A2E]）的形成，这可能影响脂质烷基链的结构特性和动力学以及整体膜，从而导致视网膜疾病。
11.7 T的眼部1H-MRS允许检测许多先前在脑MRS中描述的代谢物。在健康的成年大鼠中，主要的可识别视网膜代谢物是乳酸、NAA、Cho、牛磺酸、Cre和Glu。在初始测量后，将动物暴露于高水平蓝光，并在长达48小时内重新扫描。蓝光，特别是440 nm波长，可以到达视网膜，而紫外线则被角膜和晶状体高度阻挡。蓝光暴露后某些代谢物的变化可被视为MRS信号源自视网膜的证据。11.7 T的眼部1H-MRS无法可靠识别通常在脑中看到的少数其他代谢物：例如mI或GABA。这可能是由于检测能力限制、视网膜组织本身的特殊性或周围组织引入的噪声所致。
蓝光是光-夜周期的重要调节因子，视网膜包含敏感的光感受器（特别是蓝锥细胞和光敏性视网膜神经节细胞）。高能量蓝光穿透角膜和晶状体到达视网膜，可能造成光创伤。在日常生活中，正常的LED照明和计算机不会产生足够的能量来影响视网膜，即使长期暴露。当眼睛暴露于高强度光源（如太阳、焊工灯和手术显微镜）时，会发生蓝光危害。几种机制描述了蓝光暴露后视网膜发生的变化。光感受器和RPE细胞损失可以通过光机械损伤（高强度光产生压缩力和微泡形成）、光热损伤（RPE和脉络膜中的黑色素吸收光子，导致分子变性并形成异常分子连接，从而导致细胞功能丧失）和光化学损伤（光吸收改变某些分子的电子状态，这些分子在随后的重排最终恢复基线时，伴随释放允许活性氧[ROS]形成的能量）来解释。光感受器细胞死亡可能通过光诱导的维生素A（对光感受器功能至关重要）改变和脂质过氧化下的细胞变性发生，在增加的ROS下。遗传和环境因素有助于光毒性下的细胞死亡，主要导致凋亡和可能的坏死。蓝光和A2E具有协同效应，加剧光化学损伤，引起炎症反应（包括释放白细胞介素1 [IL-1]、肿瘤坏死因子-α [TNF-α]、caspase-1和单核细胞粘附因子[MCP-1]）、DNA损伤、抑制线粒体并伴随caspase蛋白激活导致凋亡增加，以及抑制溶酶体功能。此外，蓝光下的血管内皮生长因子（VEGF）激活增加了血管通透性。蓝光产生的视网膜改变类似于在各种眼部疾病中看到的改变：AMD、青光眼或糖尿病视网膜病变。氧化应激甚至可能在低剂量（1–20 J/cm2）下出现。计算机行业已适应这一证据，提供更好的保护以防止计算机屏幕发出的蓝光。特殊类型的眼镜提供类似的保护，而白内障手术后植入的人工晶状体可能为同样效果而呈黄色调。蓝光滤镜使LED暴露细胞的凋亡减少56%–89%，DNA损伤减少57%–81%。
蓝光暴露诱导了1H-MRS谱图的变化。脂质增加，这可能与视网膜光毒性损伤中提出的脂褐素变化一致。蓝光可能对脂褐素积累和A2E介导的光毒性效应有影响。A2E是蓝光激发的关键荧光团，导致ROS积累。
凋亡损伤与蓝光有关，可通过观察到的NAA减少来估计。NAA峰也发生偏移，向乳酸分布。暴露后10分钟NAA急剧减少，之后稳定，伴有波动。NAA在80分钟时仍减少，在接下来的24小时内更稳定，并在48小时时呈现显著且持续的减少。
Glu在蓝光暴露后立即减少。从暴露后20分钟起，Glu水平持续增加，直至48小时。
葡萄糖在暴露后立即减少，之后稳定。在80分钟时，仍有轻微减少，在接下来的24小时内无变化，并在48小时时恢复。
乳酸峰在暴露后10分钟显著增加，并在随后的检查中持续增加。在80分钟扫描和24小时扫描之间，有少量减少；然后，乳酸在48小时时再次增加。
这些代谢变化也证明视网膜已成功暴露于蓝光。高照度（6000 lx）被认为是造成最大变化所必需的，因为先前不了解眼部区域MRS的鉴别能力。大鼠眼睛具有解剖特殊性。进入大鼠眼睛的光量高于人类，因为其接受角（几乎比人眼大三倍），这意味着光可以从更广的范围进入。
在急性光照下，RPE区域损伤增加，视网膜锥体区域损伤较少。RPE控制营养物质向光感受器的转运并支持视觉周期。RPE控制视网膜中的脂质光氧化和氧化应激，作为一种防御系统。视网膜光感受器是全身最大的能量消耗者，尤其是处理葡萄糖。预计葡萄糖水平在代谢危机期间波动。来自脉络膜的葡萄糖通过RPE到达视网膜光感受器，在那里通过有氧糖酵解转化为乳酸。乳酸被释放到光感受器间基质和RPE水平。抑制RPE中的葡萄糖消耗（可能在蓝光暴露期间发生）可能导致进入视网膜的葡萄糖量增加。
4.2 局限性
我们的研究是首次眼部活体MRS研究，聚焦于视网膜。小的ROI尺寸（将200 μm厚的组织整合在体素中心）导致比脑成像更高的噪声。信号来源不能仅限于视网膜，还包括玻璃体、晶状体或眶组织。眼部1H-MRS研究存在相当多的挑战：小的ROI意味着对准困难、重复检查精度低以及识别信号来源（视网膜或周围组织）的困难。我们试图通过蓝光刺激克服后者：视网膜可能是刺激后所有代谢变化的来源。其他困难依赖于具有许多组织界面的体积匀场、水抑制伪影和长测量时间。
另一方面，据我们所知，目前尚无规范数据允许将我们的数据与其他视网膜活体研究进行比较。历史上，MRS仅在个体眼组织上进行。一项在14.1 T下研究视网膜代谢物的1H-MRS研究分析了来自人类供体（死后）的视网膜组织，并鉴定了25种代谢物，包括乳酸、Glu、Cho、mI、牛磺酸和腺苷三磷酸（ATP）。分析显示血管组织（包括视网膜）和无血管组织（角膜和晶状体）之间存在一些生化差异，而差异最大的是最远的结构——视网膜和角膜。视网膜显示较少的ATP，但乳酸和牛磺酸含量较高。Cho水平在视网膜中较高，而在晶状体中未归属。
眼球的离体探索揭示了与活体MRS相似的谱图，证实了该方法的有效性。避免运动伪影和背景噪声允许了更好的分辨率，但结果与活体研究平行。化学位移和峰形保持相似，主要差异是定量的而非定性的，正如主动代谢停止后期望的那样。
眼部MRS与其他方法相比如何？拉曼光谱能够检测视网膜中的选择性代谢物。基于共焦共振拉曼显微镜检测到类胡萝卜素，即玉米黄质和叶黄素。用于多巴胺触发的表面增强拉曼散射与金纳米探针可以高精度检测多巴胺。拉曼光谱主要局限于视网膜的体外研究，存在激光安全性、检测便利性和准确性的问题。关于视网膜特征性神经代谢物的数据在拉曼相关研究中缺失，除少数例外，这些研究专注于类胡萝卜素检测（与AMD机制相关）。在2021年的一项研究中，作者通过将扫描激光检眼镜连接到光谱仪构建了拉曼分析仪原型，并能够检测多发性硬化症患者NAA水平的下降以及视神经炎症情况下Glu的长期增加。总之，视网膜MRS没有其他非侵入性技术研究视网膜的可比结果。
显然，必须通过眼部MRS研究更多的样本以创建规范数据库。我们的研究仅调查了用于校准和采集的少量动物。通过比较文献中与其他组织（主要是大脑）规范的数据来识别代谢物（脑MRS是一种成熟程序）。没有对代谢物变化进行死后验证，考虑到1H-MRS可能在视网膜研究中具有价值的原因之一是它避免了牺牲动物。
4.3 未来方向与临床前景
MRI波谱可能成为视网膜损伤的早期非侵入性标志物。在这项初步研究中，观察到急性暴露于蓝光后的视网膜代谢变化。我们可以安全地研究动物视网膜的凋亡（NAA减少）或乳酸和Glu增加。所有动物在检查后存活，没有因MRI或全身麻醉引起并发症。
预计MRS将成为非侵入性活体监测视网膜神经元健康、能量代谢和其他细胞过程的宝贵工具。此外，它可能通过加速针对眼部内部结构的预防或治疗药物制剂的开发，彻底改变眼部药物发现。记录在眼后段的关键生物标志物的相对谱图变化可用于活体监测治疗功效或活性药物成分的间接药代动力学特征。在同一活体个体内自我参照（一只眼治疗，一只眼不治疗）的可能性可以显著提高检测真实药物效应的灵敏度，减少所需动物的数量，符合3R原则（侧重于替代、减少和优化），更强的受试者内比较可以提高统计效率，旨在支持有效性、安全性或暴露一致性的主张。尽管如此，需要高能量MRI以更好地鉴别代谢物。现有
