Bushen Wenyang Huayu方剂通过抑制Let-7b-Bach1通路来对抗氧化损伤，从而在治疗子宫内膜异位症中的作用机制

《Journal of Equine Veterinary Science》：Mechanism of Bushen Wenyang Huayu Formula against oxidative damage by Let-7b-Bach1 in the treatment of endometriosis

本研究探讨 Bushen Wenyang Huayu Formula (BWHF) 治疗子宫内膜异位症（EMs）的分子机制。通过动物实验和体外模型，发现 BWHF 上调 Let-7b 表达，抑制 Bach1，促进 Nrf2 介导的 HO-1 信号通路激活，减轻氧化应激，从而抑制异位病灶形成。该机制为 BWHF 临床应用提供理论依据。

　　

张英梅|罗琳|刘林娟|胡书婵|牛若冰|徐宇|刘琪|吴世星|孙颖|赵健|张宇|何明

中国河北省石家庄市河北中医学院整合医学研究所肝肾病理整合医学重点实验室，邮编050200

摘要

民族药理学相关性

子宫内膜异位症（EMs）是一种常见且具有挑战性的妇科疾病，目前的治疗效果并不理想。中医在治疗EMs方面具有诸多优势。 Bushen Wenyang Huayu 方剂（BWHF）作为一种中药方剂，在治疗子宫内膜异位症方面表现出显著的临床疗效。然而，其确切的分子机制尚不清楚。

研究目的

微小RNA（miRNA）和氧化应激（OS）在子宫内膜异位症的发生和发展中起着关键作用。本研究旨在探讨BWHF通过改变EMs中的miRNA来影响OS的表观遗传机制。

材料与方法

将50只雌性SD大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量BWHF组（BWHF-L）、高剂量BWHF组（BWHF-H）和孕三酮组，每组各10只大鼠。通过自体移植建立子宫内膜异位症大鼠模型。对照组和模型组给予蒸馏水，治疗组给予BWHF或孕三酮。通过评估异位病灶体积和形态、炎症细胞因子水平以及ROS水平来评价BWHF对子宫内膜异位症的治疗效果。利用CISH检测Let-7b的表达。将人子宫内膜基质细胞（hESCs）暴露于H₂O₂中以建立氧化应激细胞模型，随后进行BWHF干预。通过伤口愈合和侵袭实验检测hESCs的迁移和侵袭能力。通过免疫组化染色、免疫荧光染色、Western blot分析和qRT-PCR检测Bach1、Nrf2和HO-1在体内的表达。使用双荧光素酶报告基因检测let-7b与Bach1 mRNA 3'-UTR的直接相互作用。

结果

BWHF治疗抑制了子宫内膜异位症大鼠的异位病灶形成。机制上，BWHF上调let-7b的表达，从而降低Bach1的表达，并解除Bach1对HO-1启动子的抑制作用。此外，BWHF提高Nrf2的水平并促进其核转位。转位的Nrf2与HO-1启动子结合，激活转录，从而对抗氧化应激并缓解子宫内膜异位症。

结论

BWHF通过上调let-7b来缓解子宫内膜异位症，let-7b抑制其靶标Bach1的表达，从而解除Bach1对HO-1启动子的抑制作用，使Nrf2的激活增强。本研究揭示了BWHF治疗子宫内膜异位症的表观遗传机制，为推进其临床应用提供了宝贵见解。

引言

子宫内膜异位症（EMs）是一种子宫内膜组织在子宫腔以外部位生长的妇科疾病。其发病率逐年上升，仅次于妇科炎症性疾病和子宫肌瘤（Peiris等人，2018年）。据报道，约10-15%的育龄妇女患有子宫内膜异位症，她们遭受着与疾病相关的疼痛和不孕困扰，严重影响患者的生活质量和健康（Mehedintu等人，2014年）。逆流性月经，即月经血液和细胞通过输卵管流入子宫外部位，被认为是子宫内膜异位症病灶形成的重要原因（Chantalat等人，2020年）。腹腔内的常驻或募集的免疫细胞释放出高水平的促炎细胞因子，这些细胞因子触发子宫内膜细胞的炎症反应，促进病灶形成和疾病进展（Lin等人，2018年）。氧化应激（OS）是指活性氧（ROS）水平与内源性抗氧化能力之间的细胞氧化还原失衡。这种状态存在于子宫内膜异位症女性的腹腔内（Ansariniya等人，2022年）。过量的ROS产生或抗氧化系统缺陷会导致氧化还原失衡，最终导致细胞损伤。普遍认为ROS的产生会增加炎症因子的释放（Nanda等人，2020年），从而促进内皮细胞、上皮细胞或基质细胞等不同细胞的增殖和侵袭（Qiu等人，2020年；Ngo等人，2009年），这是子宫内膜异位症的典型特征之一。因此，抵抗氧化损伤的策略是研究的重点。微小RNA（miRNAs）普遍存在于真核细胞中，它们特异性地结合到目标信使RNA（mRNAs）的3′-非翻译区（3′-UTR）的互补序列上，从而影响细胞过程的转录后调控和基因表达的沉默或降解（O'Brien等人，2018年）。先前的研究表明，异位子宫内膜和正常子宫内膜之间的miRNAs表达存在显著差异，这些差异表达的miRNAs可能与子宫内膜异位症有关（Bjorkman和Taylor，2019年）。Let-7家族是最早在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中发现的miRNAs之一。Let-7b在多种疾病中发挥调节作用。研究表明，Let-7b通过抑制己糖激酶2介导的有氧糖酵解来抑制肿瘤转移（Li等人，2023年）。Let-7b参与TGF-β1介导的肾纤维化（Wang等人，2014年），通过下调IGF1来抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移（Zhang等人，2022年），并促进巨噬细胞极化以缓解糖尿病皮肤伤口的慢性炎症（Ti等人，2015年）。此外，Let-7b还能增强肝细胞抵抗氧化损伤的能力（Hou等人，2012年）。临床研究表明，子宫内膜异位症患者的Let-7b表达水平较低（Cosar等人，2019年），这可能与其调控区域的甲基化有关（Meixell等人，2022年）。这些发现表明Let-7b通过调节氧化应激参与子宫内膜异位症的治疗。中医在治疗子宫内膜异位症方面具有巨大潜力。在古代中医文献中，子宫内膜异位症被归类为“痛经”（记载于东汉张仲景所著的《金匮要略》）、“月经不调”（记载于隋朝巢元方所著的《诸病源候论》）、“腹部肿块”（记载于秦汉时期的《神农本草经》）等病症。公认“血瘀”是子宫内膜异位症最根本的病理基础（中国中西医结合医学协会妇产科专业委员会，2019年）。中国中医协会发布的《中西医结合诊疗子宫内膜异位症指南》（标准编号：T/CACM 1446-2023）将子宫内膜异位症分为五种证型：气滞血瘀、寒凝血瘀、气虚血瘀、肾虚血瘀和痰瘀互结。目前最常见的证型是寒凝血瘀。最早记载寒凝血瘀导致女性月经腹痛的文献是《诸病源候论》（Zhang等人，2023年）。因此，中医常以“活血化瘀、温经止痛”作为治疗子宫内膜异位症的基本原则。Bushen Wenyang Huayu 方剂（BWHF）源于少府逐瘀汤（SFZYD）。SFZYD源自清代王清仁所著的《医林改错》，具有活血化瘀、温经止痛的良好效果。临床实践证明，BWHF通过调节免疫炎症（Chen等人，2021年）、增强子宫内膜受体敏感性（Li等人，2021年）和改善血液循环（Wu等人，2023年）对子宫内膜异位症相关的痛经和不孕具有独特疗效。BWHF通过促进血液循环和消除血瘀来显著缓解子宫内膜异位症症状（Li等人，2022年）。临床研究发现，BWHF的总有效率为82.00%，并能降低血清中的VEGF和癌抗原125（CA125）水平（Chen等人，2010年）。先前的研究表明，BWHF通过抑制TRPV1和NGF来缓解子宫内膜异位症的疼痛（Chen等人，2015年）。BWHF通过减少缺氧诱导因子-1 α（HIF-1α）的表达来缓解子宫内膜异位症的缺氧状态（Jia等人，2015年）。此外，BWHF可通过沉默信息调节因子1（SIRT1）-FOXO1信号通路抑制子宫内膜异位症大鼠的自噬（Li等人，2023年）。然而，BWHF是否能够调节Let-7b对氧化损伤的抵抗力仍需进一步研究。

本研究探讨了Let-7b在子宫内膜异位症进展过程中对OS的体内和体外影响，并探索了BWHF通过Let-7b抑制OS治疗子宫内膜异位症的机制，为临床治疗提供了实验依据。

BWHF的制备

BWHF的药材购自中国医药集团乐仁堂医药有限公司。BWHF的组成见表1。所有药材浸泡在蒸馏水中30分钟后，于100°C煎煮20分钟。过滤后，再次煎煮两次。第二次煎煮10分钟后加入肉桂，继续煎煮10分钟。将两次煎煮的滤液合并浓缩，得到最终浓度为3.9的BWHF溶液。

BWHF成分分析

使用UHPLC-MS/MS分析方法分析了BWHF的化学成分，结果见图2和补充图S1。BWHF的化学成分包括（3E）-3-己二酸、苯丙氨酸、Tyr-Val、3-吲哚乳酸、布特因、瑞替胺、槲皮素、阿塔米辛酸、壬二酸、瑞替丁等。具体化学成分的名称及相关信息见表3。

BWHF减少子宫内膜异位症中的异位病灶形成

子宫内膜异位症

讨论

子宫内膜异位症是一种慢性、炎症性的、依赖雌激素的妇科疾病（Wu等人，2017年）。该疾病由多种因素引起，主要通过粘附、侵袭和血管生成等病理过程，这些过程与内分泌、自身免疫、遗传和环境等因素相关。本研究发现，子宫内膜异位症与氧化损伤有关，其特征是let-7b表达降低，Bach1表达增加，进而导致HO-1表达减少。BWHF治疗抑制了这些病理过程。

结论

BWHF通过靶向let-7b来抑制Bach1的表达，从而缓解Bach1对HO-1的抑制作用。同时，BWHF提高Nrf2的水平并促进其核转位，使Nrf2能够结合HO-1启动子并激活其转录。这种协同作用增强了细胞对氧化损伤的防御能力。需要进一步研究以了解BWHF如何上调let-7b。鉴于circRNAs可以作为竞争性内源性RNA（ceRNAs）发挥作用……

CRediT作者贡献声明

张英梅：撰写初稿、进行研究、进行正式分析、数据管理。罗琳：撰写初稿、进行研究。张宇：撰写、审稿与编辑、方法学设计、概念构思。何明：撰写、审稿与编辑、资金争取、概念构思。刘琪：撰写、审稿与编辑、进行研究。吴世星：撰写、审稿与编辑、进行研究。孙颖：撰写初稿、方法学设计。赵健：撰写、审稿与编辑、方法学设计。刘林娟：

未引用参考文献

Li等人，2023年；吴和苗，2023年。

数据可用性声明

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明本研究在没有任何可能构成利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号：82074247）、河北省科技计划（编号：21377771D）、河北省自然科学基金（编号：H2023423056）、河北中医学院的研究生创新资助计划（编号：XCXZZSS2023018）以及河北省研究生创新资助计划（编号：CXZZSS2024070）的支持。

利益冲突声明

作者声明本研究在没有任何可能构成利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。