《Advanced Science》：PDZK1-ULK1 Axis Triggers Lipophagy to Inhibit Tumor Progression and Sunitinib Resistance in Clear Cell Renal Cell Carcinoma
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本研究揭示了PDZK1-ULK1信号轴在肾透明细胞癌（ccRCC）中的新机制。低表达的PDZK1通过解除对转录因子LEF1的胞质锚定，促进其入核抑制ULK1转录，从而损害脂噬（lipophagy）并导致脂滴（LDs）异常堆积，这驱动了肿瘤进展与舒尼替尼（sunitinib）耐药。研究证实，激活ULK1可恢复脂噬、清除脂滴并逆转耐药，为克服ccRCC治疗困境提供了新靶点与联合策略。
1 引言
肾细胞癌（RCC）是泌尿系统常见的恶性肿瘤，其中肾透明细胞癌（ccRCC）是最主要的亚型。ccRCC的一个显著病理特征是细胞内脂滴（LDs）的异常堆积，这种现象显著促进了肿瘤进展和治疗抵抗。脂滴曾被视为被动的脂质储存库，如今被认识到是参与脂质代谢的动态细胞器，通过与多种细胞器相互作用，调节氧化应激、减少内质网（ER）应激并维持代谢稳态。在癌细胞中，这些功能被增强以满足快速增殖肿瘤的高代谢需求。
脂滴的核心包含胆固醇酯（CEs）和甘油三酯（TGs）等中性脂质，作为能量和膜合成的储备。在ccRCC中，异常的脂滴积累是支持肿瘤生长的代谢重编程的核心部分。ccRCC中异常的脂质积累源于脂质生物合成的增加和脂质分解代谢的受损。脂噬（lipophagy），一种选择性的自噬形式，对于脂滴的降解至关重要。然而，在ccRCC中，脂噬常常受损，导致病理性脂滴积累，从而促进肿瘤进展和治疗抵抗。
鉴于脂滴在ccRCC生物学中的关键作用，靶向脂滴稳态提供了一种潜在的治疗策略。ULK1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1）作为自噬和脂噬的关键调节因子，在脂滴降解中扮演重要角色，但其在ccRCC脂质代谢中的作用尚不清楚。本研究旨在探索PDZK1-ULK1轴在ccRCC脂滴代谢、肿瘤进展及舒尼替尼耐药中的作用与机制。
2 结果
2.1 PDZK1抑制ccRCC中的脂滴积累
为了鉴定脂滴降解的关键调节因子，研究者通过生物信息学分析结合患者生存数据，筛选出与脂滴降解增强和患者总生存期改善相关的七个候选基因。进一步的生存分析和功能验证表明，PDZK1是与脂滴降解和良好临床结果相关的最强候选基因。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析显示，PDZK1的表达主要局限于上皮细胞，且PDZK1高表达的细胞显示出更高的脂滴降解评分。体外功能实验证实，敲低PDZK1会增加脂滴沉积，而过表达PDZK1则会降低脂滴水平。体内研究同样表明，在PDZK1敲低的原位肾肿瘤模型中，肿瘤脂滴积累显著增加。这些结果共同证明，PDZK1通过促进脂滴降解来减弱ccRCC中的脂滴积累。
2.2 PDZK1激活自噬以促进ccRCC细胞中的脂滴降解
基因集富集分析（GSEA）显示，具有高脂滴降解评分的ccRCC患者样本中自噬通路显著富集，而脂肪分解通路未发生改变，提示脂噬在ccRCC细胞的脂滴降解中起关键作用。同时，PDZK1高表达的患者样本也显示出自噬通路的富集。
通过蛋白质印迹、mCherry-GFP-LC3报告系统和透射电子显微镜等多种技术证实，PDZK1过表达显著提高了LC3B-II/LC3B-I比率，上调了ATG5和ATG7的表达，同时降低了p62的水平，表明自噬流增强。相反，PDZK1敲低则产生相反效果。这些数据表明，PDZK1激活了ccRCC细胞中的自噬，可能通过促进脂噬来有效降解脂滴。
2.3 PDZK1增强自噬介导的ccRCC细胞脂滴清除
为了确定PDZK1是否通过促进脂噬来加速脂滴周转，研究者在过表达PDZK1的细胞中使用自噬体形成抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）。结果显示，3-MA显著逆转了PDZK1过表达诱导的脂滴降解。同样，使用溶酶体抑制剂氯喹（CQ）处理也阻止了PDZK1介导的脂滴清除，表明溶酶体活性对于此过程是必需的。
共聚焦显微镜观察显示，在PDZK1过表达的细胞中，自噬体（标记为LC3）与脂滴（标记为BODIPY）之间的共定位增强，表明PDZK1促进了自噬体对脂滴的包被。同时，脂滴与溶酶体（标记为LAMP2）的共定位也增强。这些结果共同证明，PDZK1通过促进自噬体-溶酶体融合，经由脂噬途径促进脂滴降解。
2.4 PDZK1通过上调ULK1表达促进脂噬
为了探索PDZK1如何调节脂噬，研究者通过整合差异表达基因与自噬相关基因集的分析，将ULK1鉴定为唯一的重叠基因。相关性研究显示，在TCGA和独立数据集GSE53757中，ULK1表达与脂滴积累的GSVA评分呈负相关。
功能分析证实，PDZK1敲低显著抑制了ccRCC细胞中ULK1的mRNA和蛋白水平，而过表达PDZK1则增加了ULK1的表达。体内实验同样显示，PDZK1敲低的肿瘤中ULK1表达降低。挽救实验进一步明确了PDZK1-ULK1轴的功能：在PDZK1过表达的细胞中敲低ULK1会消除自噬激活；而在PDZK1敲低的细胞中过表达ULK1则能恢复自噬。油红O染色表明，PDZK1过表达增强的脂滴降解可被ULK1敲低所逆转。这些结果共同证明，PDZK1-ULK1轴对于激活脂噬和调节ccRCC细胞中的脂滴动态至关重要。
2.5 LEF1介导PDZK1依赖的ULK1转录调控
GSEA分析和UpSetR分析发现，Wnt/β-连环蛋白信号通路是低PDZK1和低ULK1表达组中最显著重叠的通路。使用Wnt/β-连环蛋白通路调节剂的实验证实，抑制该通路可以逆转PDZK1敲低导致的ULK1表达抑制，而激活该通路则会减弱PDZK1过表达引起的ULK1上调。
通过生物信息学预测和实验验证，研究确定LEF1是ULK1的功能性转录调节因子。CUT&Tag-qPCR和双荧光素酶报告基因实验证实，LEF1直接结合到ULK1启动子区域并抑制其转录。功能验证表明，敲低LEF1可以挽救PDZK1敲低细胞中ULK1的表达和自噬流，并逆转脂滴积累。这些发现揭示了LEF1在介导PDZK1依赖的ULK1调控及其对脂噬影响中的关键作用。
2.6 PDZK1通过直接相互作用抑制LEF1核转位
PDZK1是一种包含PDZ结构域的支架蛋白。研究者发现LEF1的C末端区域包含一个保守的II型PDZ结合基序（AAYI）。免疫共沉淀（Co-IP）实验和分子对接模拟证实，PDZK1通过其PDZ1结构域直接与LEF1的C末端相互作用。
亚细胞分级分离和免疫荧光实验显示，PDZK1过表达减少了核内LEF1水平，而PDZK1敲低则增加了核内LEF1积累，但总LEF1蛋白水平不变。这表明PDZK1影响了LEF1的亚细胞分布而非其总表达量。机制上，蛋白质-蛋白质对接模拟表明，PDZK1的结合空间位阻了LEF1与核输入蛋白importin α5之间的相互作用，Co-IP实验也证实了这一点。综上所述，PDZK1作为LEF1的胞质锚，阻止其核转位，从而抑制LEF1依赖的ULK1转录。
2.7 PDZK1-ULK1轴通过激活脂噬抑制ccRCC进展
体内皮下肿瘤模型显示，PDZK1过表达显著降低了肿瘤体积和重量。免疫组织化学（IHC）分析表明，PDZK1过表达的肿瘤中LC3和ULK1表达水平升高，核LEF1表达和脂滴积累减少。这些结果提示PDZK1介导的脂噬在抑制体内ccRCC进展中起着关键作用。
为了研究ULK1的功能贡献，研究者使用选择性ULK1激动剂LYN-1604处理ccRCC细胞。在PDZK1敲低的细胞中，LYN-1604处理恢复了自噬流，并显著减少了脂滴积累和细胞活力。体内实验同样证实，LYN-1604处理能抑制肿瘤生长并促进脂滴降解。这些发现揭示了一种新的治疗机制：PDZK1通过促进ULK1依赖的脂噬来降解致癌性脂滴，从而抑制ccRCC进展。
2.8 ULK1激动剂使PDZK1缺陷导致的高脂滴积累肿瘤对舒尼替尼敏感
脂滴积累是ccRCC中舒尼替尼耐药的已知驱动因素。临床数据分析显示，低PDZK1表达与舒尼替尼的不良反应相关。体外实验表明，PDZK1敲低显著增加了舒尼替尼的IC50值，降低了敏感性，而过表达PDZK1则恢复了敏感性。
研究者建立了舒尼替尼耐药的ccRCC细胞系（SU-R-786O），该细胞系表现出脂滴积累增加、PDZK1和ULK1表达降低以及自噬流受损。在PDZK1敲低或舒尼替尼耐药的细胞中使用ULK1激动剂LYN-1604处理，能够重新使其对舒尼替尼敏感。值得注意的是，舒尼替尼或LYN-1604单药治疗的抑制效果有限，但两者联合应用则能协同抑制细胞活力。
体内实验进一步验证了联合疗法的疗效。在PDZK1缺陷的ccRCC模型中，舒尼替尼单药治疗未能显著抑制肿瘤，而LYN-1604与舒尼替尼联合治疗则显著抑制了肿瘤生长，减少了脂滴积累，并增强了自噬相关蛋白的表达。对ccRCC患者样本的IHC分析显示，舒尼替尼应答者中PDZK1和ULK1表达更高，核LEF1更少。受试者工作特征（ROC）曲线分析表明，ULK1表达对预测舒尼替尼反应具有很高的价值（AUC = 0.9063）。
3 讨论
代谢重编程是ccRCC的一个突出特征，表现为过度的脂滴积累。本研究基于多个独立队列的数据观察到，PDZK1表达降低与ccRCC中脂滴积累增加和不良预后相关。scRNA-Seq和bulk RNA-Seq数据的整合分析进一步揭示了PDZK1表达与ccRCC患者上皮（肿瘤）细胞亚群中脂滴降解呈正相关。这是首个确立PDZK1促进脂滴降解的研究，为ccRCC脂质代谢调控提供了新见解。
促进脂滴降解是减少ccRCC脂质积累的关键策略。本研究首次揭示了ccRCC中以前未被探索的自噬依赖性脂滴降解途径。通过功能实验，证实PDZK1表达促进了自噬体与脂滴的共定位及其随后与溶酶体的融合，表明PDZK1促进了自噬性脂滴周转。这些发现揭示了ccRCC细胞中一种新的自噬依赖性脂滴降解途径，并突出了PDZK1介导的脂噬在缓解脂滴积累中的作用。
为了阐明PDZK1调节脂噬的分子机制，研究者将ULK1鉴定为唯一与PDKZ1相关的自噬相关差异表达基因。研究进一步发现，抑制Wnt/β-连环蛋白通路介导了PDZK1对ULK1的上调。通过整合计算预测和实验验证，证明LEF1直接结合ULK1启动子并抑制其转录。这项研究阐明了ULK1转录抑制的一种新机制，突出了Wnt/β-连环蛋白通路与自噬调控之间的相互作用。
PDZ结构域蛋白可通过与转录因子相互作用来调节其稳定性、核转位或转录活性。本研究发现LEF1的C末端区域包含一个II型PDZ结构域结合基序（A-A-Y-I），该基序与PDZK1相互作用。这种相互作用抑制了LEF1的核转位和转录活性，从而抑制了ULK1表达和自噬活性。我们的研究阐明了PDZK1作为一种支架蛋白，抑制LEF1核转位和转录活性的新分子机制。
舒尼替尼是一种多受体酪氨酸激酶抑制剂，是肾细胞癌的一线治疗药物。然而，耐药性限制了其疗效。最近，过度的脂滴积累与ccRCC中的舒尼替尼耐药有关。靶向ccRCC脂质代谢的疗法可以改善患者预后并克服舒尼替尼耐药。本研究证明，ULK1的小分子激动剂LYN-1604通过增强ccRCC细胞的自噬促进了脂滴降解。重要的是，联合使用LYN-1604和舒尼替尼治疗可协同抑制肿瘤生长。这种方法不同于传统的靶向脂质代谢的疗法，为恢复脂滴稳态和克服耐药性提供了一种新的临床策略。
4 材料与方法（略）
4.1 细胞系与细胞培养
4.2 抗体与试剂
4.3 免疫共沉淀
4.4 蛋白质印迹
4.5 RNA分离与实时定量PCR
4.6 免疫组织化学
4.7 免疫荧光
4.8 油红O染色
4.9 BODIPY染色
4.10 小鼠研究
4.11 统计分析
4.12 蛋白质-蛋白质对接
5 结论
本研究揭示了ccRCC中脂滴降解的一种新的自噬依赖性途径。PDZK1通过上调ULK1和激活脂噬来抑制肿瘤进展和舒尼替尼耐药。临床前研究表明，LYN-1604联合疗法可以通过减少脂滴积累来提高舒尼替尼的抗肿瘤效果。此外，ULK1可以作为舒尼替尼疗效的预测性生物标志物，有可能为ccRCC患者制定个性化的治疗策略。
