《Advanced Science》：Diabetes Mellitus Facilitates Gallstone Formation Through CXCR2-NETs–Mediated Liver-Bile Barrier Damage
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本文揭示了糖尿病促进胆石症的全新病理机制：通过激活肝内中性粒细胞上的CXCR2受体，诱导中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的过度形成。NETs释放的蛋白酶破坏了肝细胞间的紧密连接，导致肝-胆屏障受损，使NETs得以进入胆汁并成为结石的核心，从而加速胆石形成。研究者还发现，肌氨酸（Sarcosine）可通过抑制CXCR2表达来抑制NETs生成，为糖尿病相关胆石症的防治提供了新的潜在治疗靶点。
1 背景
胆石症是全球范围内主要的健康负担，影响着约10%-15%的成年人口。作为一种常见的代谢紊乱疾病，糖尿病被认为是增加胆石形成风险的重要因素。过去的研究已观察到糖尿病患者在胆囊切除术中经历了更多的不良事件，提示这两种疾病可能存在共同的潜在机制。因此，探讨糖尿病如何促进胆石形成及其分子机制，对于这两种代谢性疾病的预防和治疗具有重要意义。
2 方法
本研究采用多维度的研究策略。首先，利用美国国家健康与营养调查（NHANES）的临床数据和孟德尔随机化（MR）分析，确定了糖尿病与胆石症之间的因果关系。通过整合多组学测序和分子动力学模拟（MDS），将CXCR2鉴定为连接这两种疾病的关键分子桥梁。随后，建立了动物模型，并应用蛋白质免疫印迹（Western blotting）、逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等多种技术手段来探索相关机制。临床样本包括来自无胆石疾病患者、无糖尿病的胆石症患者以及伴有糖尿病的胆石症患者的肝组织、胆囊组织、血清和胆汁样本。
3 结果
3.1 NHANES数据库分析表明糖尿病是胆石形成的危险因素
纳入3972名参与者的数据分析显示，糖尿病与胆石症风险增加独立相关。在校正了年龄、性别、种族、吸烟状况、饮酒、贫困比率和身体质量指数（BMI）等多重混杂因素后，这种正相关关系依然显著（优势比 OR = 1.60，P= 0.005）。此外，与糖尿病相关的指标，如空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）和胰岛素抵抗评估指数（HOMA-IR、METS-IR），也与胆石症发生率呈正相关。
3.2 孟德尔随机化分析和动物实验证实糖尿病与胆石形成的因果关系
孟德尔随机化分析表明，空腹胰岛素水平和2型糖尿病与胆石症风险呈显著正相关。动物实验结果进一步支持了这一因果关系：与正常饮食（ND）小鼠相比，仅喂食致石饮食（LD）的小鼠胆石形成增加，而在模拟糖尿病的ob/ob小鼠中喂食致石饮食（DMLD）则进一步显著加剧了胆石形成。
3.3 糖尿病促进CXCR2表达增加
通过整合差异基因表达、网络药理学和靶向基因的孟德尔随机化分析，CXCR2被确定为糖尿病与胆石症的共同枢纽基因。临床样本检测发现，糖尿病合并胆石症患者血清中的CXCR2水平显著高于单纯胆石症患者和健康对照，且与血糖浓度呈正相关。分子动力学模拟和表面等离子体共振（SPR）实验证实葡萄糖能够稳定结合CXCR2蛋白。动物实验显示，糖尿病小鼠肝脏中的CXCR2蛋白表达显著上调。
3.4 肝脏中性粒细胞中CXCR2表达增加是糖尿病诱发胆石形成的关键因素
对人和小鼠肝脏组织的单细胞RNA测序及免疫荧光分析显示，CXCR2主要在肝脏的中性粒细胞中表达。在胆石症患者和糖尿病模型小鼠中，肝脏中性粒细胞的CXCR2表达显著升高。通过腺相关病毒敲低糖尿病小鼠肝脏CXCR2的表达，可以完全阻断糖尿病对胆石形成的促进作用，表明CXCR2是糖尿病促进胆石症的关键介质。
3.5 NETs在胆石疾病中发挥重要作用
基因富集分析发现，胆石症患者肝脏中性粒细胞的差异表达基因以及高表达CXCR2的中性粒细胞的差异表达基因，均显著富集于“中性粒细胞脱颗粒”通路，这是中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成的关键步骤。临床样本和动物实验均证实，在糖尿病合并胆石症的个体中，肝脏、外周血和胆汁中的NETs标志物，如瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、髓过氧化物酶（MPO）及其DNA复合物（MPO-DNA）水平显著升高，且与血清CXCR2水平呈正相关。使用DNase I降解NETs，能有效抑制糖尿病小鼠的胆石形成。
3.6 CXCR2通过诱导NETs形成促进胆石症
机制研究表明，抑制CXCR2表达可以显著降低糖尿病小鼠胆汁和肝脏中的NETs水平。相反，使用PMA诱导NETs形成，则可以逆转CXCR2敲低对胆石形成的抑制作用。这些结果直接证实了CXCR2通过诱导NETs形成来促进胆石症发展的因果链。
3.7 糖尿病通过破坏肝脏紧密连接促进NETs释放入胆汁
一个关键问题是：肝脏中形成的NETs如何进入胆汁？通过单细胞测序和KEGG通路富集分析发现，胆石症患者和胰岛素抵抗小鼠的肝细胞差异表达基因均显著富集于“紧密连接”信号通路，且相关基因表达下调。透射电镜观察证实，糖尿病破坏了小鼠肝细胞间的紧密连接结构。这种紧密连接的破坏为肝脏中形成的NETs进入胆汁提供了通道。进一步实验发现，使用SEW2871保护紧密连接，可以有效减少胆汁中的NETs并抑制胆石形成，但并不影响肝脏本身NETs的生成，这支持了“屏障破坏是NETs入胆汁前提”的假说。
3.8 肝脏NETs增加是糖尿病破坏肝细胞紧密连接的核心病理过程
研究发现，使用PMA增加NETs会加剧肝细胞紧密连接的破坏，而使用DNase I清除NETs则可以保护紧密连接。体外共培养实验进一步揭示，NETs中的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和髓过氧化物酶（MPO）协同作用，是降解和破坏肝细胞紧密连接的关键因子。在糖尿病状态下，肝脏NETs的过量生成和紧密连接的破坏是平行发生、相互关联的核心事件。
3.9 肌氨酸通过抑制CXCR2表达抑制糖尿病诱导的胆石形成
基于上述机制，研究者从BATMAN-TCM数据库筛选出肌氨酸（Sarcosine）作为潜在的CXCR2调节剂。分子对接证实肌氨酸可直接与CXCR2蛋白结合。体内实验表明，肌氨酸治疗能显著降低糖尿病小鼠肝脏CXCR2的表达，抑制NETs形成，保护肝细胞紧密连接，从而减少胆石形成。而使用CXCR2激动剂Ac-PGP则可以逆转肌氨酸的这些保护作用。与经典的CXCR2功能抑制剂SB225002相比，肌氨酸主要通过下调CXCR2蛋白表达来发挥作用，虽然对NETs的抑制程度略弱，但在抑制糖尿病诱导的胆石形成方面达到了相当的治疗效果，且脱靶效应小。
