从无乳链球菌中鉴定一种新型复合整合性接合元件 ICESag08 介导氯霉素和大环内酯类抗生素耐药性的传播机制研究

《Journal of Global Antimicrobial Resistance》：ICE Sag08: A New Composite Integrative and Conjugative Element from Streptococcus agalactiae Mediating Resistance to Chloramphenicol and Macrolides

本研究聚焦于无乳链球菌中多重耐药性的传播难题，研究人员对一株临床分离菌株进行基因组学分析，鉴定出一种新型复合整合性接合元件 ICESag08。该元件大小为133 kb，包含四种已知ICE模块，可稳定整合于细菌染色体的rplL位点，并在实验中显示出可接合转移性，但同时对宿主菌株造成一定的适应性代价。该研究揭示了复合ICE是多重耐药基因（包括catQ、mef(I)和erm(TR)）传播的重要载体，为理解耐药性在革兰阳性菌中的进化与传播机制提供了新见解。

　　

在抗生素耐药性日益严峻的全球公共卫生背景下，革兰阳性菌，特别是无乳链球菌，已成为临床治疗的棘手挑战。这种细菌不仅能感染新生儿、孕妇和老年人，近年来在非妊娠成人中的发病率也在上升。其中，氯霉素和红霉素、克林霉素等大环内酯-林可酰胺-链阳霉素B类抗生素的耐药问题尤为突出。问题的核心在于，这些耐药基因并非孤立存在，它们常常搭乘一类名为“整合性接合元件”的“可移动基因大巴”在细菌间传播。这些ICE元件像一个模块化的工具箱，既能将自己整合到细菌的染色体中，又能通过“细菌接合”的方式转移到新宿主，是耐药性快速扩散的关键推手。然而，一个特别引人担忧的趋势是，这些ICE元件自身也会相互组合，形成庞大而复杂的“复合ICE”，它们能打包携带多种耐药基因，一次性赋予细菌多重耐药性。本研究发现的ICE_{Sag08，正是这样一个“超级工具箱”。}

本研究由河南科技大学应用工程学院的刘永辉团队开展，相关论文发表在《Journal of Global Antimicrobial Resistance》上。为了探究无乳链球菌中氯霉素耐药性的传播机制，研究人员对一株耐氯霉素的临床无乳链球菌分离株进行了深入的基因组学分析和功能验证。他们发现了一个前所未有的巨型复合ICE，并通过一系列实验揭示了其结构、转移能力以及对细菌适应性的影响，为理解耐药基因的“打包”传播提供了重要案例。

在研究过程中，团队主要应用了以下关键技术方法：首先，通过对38株临床分离的无乳链球菌进行药物敏感性测试，筛选出高耐氯霉素的菌株Sag08，并利用Illumina平台进行全基因组测序。其次，运用生物信息学工具（如Mauve、SPAdes）对测序数据进行组装、比对和注释，识别出可能的移动遗传元件，并与已知的ICE数据库（如ICESpn529IQ、ICESan95_hsdM等）进行比较分析。接着，通过PCR扩增和桑格测序连接不同序列支架，获得完整的ICE_{Sag08序列。然后，设计并使用特定抗生素组合的培养基，在无乳链球菌供体菌Sag08和受体菌SagR31m之间进行接合实验，验证ICE的可转移性。最后，通过体外生长曲线测定、竞争性适应性实验以及长达60代的连续传代培养，评估了ICESag08对宿主细菌的生长、竞争力和遗传稳定性的影响。}

研究结果揭示了复合ICE_{Sag08的多重特性：}

3.1. catQ阳性菌株的初步特征

在38株临床菌株中，Sag08对氯霉素呈现高水平耐药。其基因组分析显示，该菌株不仅携带氯霉素耐药基因catQ，还携带大环内酯类耐药基因mef(I)和erm(TR)、四环素耐药基因tetM以及重金属抗性基因cadA。通过将该菌株的基因组与参考基因组比对，可以清晰看到多个差异区域，这些区域是潜在的移动遗传元件。

3.2. 携带catQ基因的ICE的特征

通过PCR连接和测序，研究人员获得了完整的ICE_{Sag08序列。它是一个长达133 kb的庞大元件，包含139个开放阅读框。比对分析发现，ICESag08是一个由四个已知ICE模块“嵌套”组成的复合体：ICESpn529IQ、ICESan95hsdM、ICESp2907和ICESpy009。其中，catQ-mef(I)位点位于ICESpn529IQ模块内，而erm(TR)基因则由嵌入在ICESan95hsdM中的非接合元件ICESp2907携带。这种结构就像是“俄罗斯套娃”，一层套一层，最终整合在染色体rplL基因的3'端。}

3.3. ICE_{Sag08的可转移性}

接合实验证实，ICE_{Sag08可以从供体菌Sag08转移至受体菌SagR31m，频率为1.05 × 10^-9。受体菌在获得ICESag08后，转变成了可耐受氯霉素、红霉素和克林霉素的“接合子”。基因组比对清晰地显示，在接合子的染色体rplL位点处，插入了这段133 kb的片段。这直接证明了ICESag08是功能完整的，能够通过水平转移传播多重耐药性。}

3.4. ICE_{Sag08在宿主中的适应性代价和稳定性}

尽管ICE_{Sag08能够成功转移，但它并非“免费午餐”。研究发现，携带该复合ICE的接合子菌株，其最大生长密度略低于原始受体菌，且在混合培养的竞争实验中处于劣势，相对适应度仅为0.71。这表明获得这个庞大的遗传元件给宿主细菌带来了显著的“适应性代价”，消耗了其部分生存资源。然而，稳定性实验带来了一个更关键的信息：在无抗生素选择压力的条件下连续传代60次，超过89%的接合子菌株依然保留了ICESag08及其赋予的耐药表型。这证明，尽管有代价，但ICESag08在宿主染色体中非常稳定，一旦获得，不易丢失。}

研究结论与讨论强调了复合ICE在耐药传播中的关键角色及其复杂性。

本研究首次在无乳链球菌中鉴定并验证了一种新型复合ICE——ICE_{Sag08的可转移性。与之前报道的、仅携带单个模块的ICE不同，ICESag08的结构极为复杂，是多个ICE模块通过类似“串联整合”和“嵌套”重组等方式形成的巨型复合体。其低接合转移频率（10^-9量级）与其它大型复合ICE相似，明显低于较小的单一ICE（10^-5至10^-7量级），暗示其庞大的尺寸和冗余的遗传内容可能增加了转移的“负担”。}

然而，研究最重要的发现在于其“权衡”机制。尽管ICE_{Sag08给细菌带来了生长和竞争上的适应性代价，但它所携带的多种耐药基因（特别是高水平的氯霉素乙酰转移酶基因catQ和erm(TR)基因）在抗生素选择压力下，为宿主提供了强大的生存优势。并且，该元件在细菌染色体中具有高度的遗传稳定性。这意味着，在临床抗生素使用所创造的选择压力环境下，携带此类复合ICE的细菌将更具竞争优势，从而促进多重耐药性的定植和传播。}

这项研究的意义深远。它不仅仅是在细菌基因组中发现了一个新的耐药元件，更重要的是揭示了一种高效的、一站式的“耐药性打包传播”模式。ICE_{Sag08像一个“耐药性瑞士军刀”，将针对不同类别抗生素的抵抗能力整合在一个可移动的单元内。这种复合ICE的出现和传播，极大地增加了临床治疗无乳链球菌等病原体感染的难度。因此，深入理解这类复合ICE的形成机制、传播动力学及其与宿主细菌的互作关系，对于开发遏制抗生素耐药性传播的新型策略至关重要。该研究为监控和预警此类“超级耐药载体”的流行提供了重要的分子靶标和理论依据。}