《International Journal of Cancer》：Detection of MSI signals from peripheral blood for monitoring response to immune checkpoint blockade therapy in patients with advanced microsatellite-unstable gastrointestinal cancers: A pilot study
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这项研究开创性地探索了外周血细胞外囊泡（EV）DNA在检测微卫星不稳定性（MSI）中的应用，为接受免疫治疗（ICB）的晚期胃肠癌患者提供了一种全新的、微创的动态疗效监测工具。研究证明，EV DNA与传统的游离DNA（cfDNA）分析结果高度一致（93%），且在治疗期间MSI状态（如从MSI转为非MSI）的动态变化是早期提示临床获益的潜在指标。这项成果有望推动精准医疗中液态活检技术的发展。
1 引言
微卫星不稳定性（MSI）是由于DNA错配修复系统（MMR）缺陷，导致重复的微卫星序列累积插入或缺失（indel）突变而形成的。大约15%的结直肠癌（CRC）和高达5%的IV期胃肠道（GI）肿瘤呈现MSI表型。MSI肿瘤因其新抗原丰度而具有高免疫原性，使其对免疫检查点阻断（ICB）治疗（如PD-1/PD-L1抑制剂）特别敏感。然而，相当一部分MSI胃肠道腺癌患者并未从ICB中获益，且缺乏用于监测治疗反应的非侵入性生物标志物。
目前，基于血浆游离DNA（cfDNA）的分析已成为研究热点。已有研究证明，在ICB治疗背景下，基于cfDNA的MSI检测具有可行性。然而，cfDNA在采集和操作上存在一些技术限制，且ICB治疗期间其检测性能的数据有限。细胞外囊泡（EV）作为由肿瘤细胞释放到循环中的纳米级、脂质双分子层包裹的颗粒，携带反映其细胞来源和生理状态的分子货物，已成为一种有前景的治疗监测工具。本研究旨在评估从外周血EV DNA和cfDNA中检测MSI状态，用于监测MSI癌症患者ICB治疗反应的潜力。
2 方法
本研究纳入了2016年1月至2021年10月期间在德国海德堡国家肿瘤中心接受ICB治疗的19例IV期GI MSI腺癌患者，以及30名健康对照个体。从患者治疗前和/或治疗期间共采集了52份血液样本和16份肿瘤样本。对于其中18名患者的血浆样本，分别从EV和cfDNA中提取DNA。
EV通过差速离心和使用总外泌体分离试剂进行分离，并通过透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）进行表征。从EV沉淀物中提取DNA，使用QIAamp DNA试剂盒。cfDNA则使用Maxwell? RSC ccfDNA血浆试剂盒从血浆中提取。MSI状态通过PCR片段分析法，使用四个诊断性单核苷酸标记物（BAT25、BAT26、CAT25和BAT40）进行评估，并以全血DNA作为正常对照。统计分析使用GraphPad Prism（版本6.07）进行。
3 结果
3.1 临床数据
19名患者中，16名为结直肠癌，2名为胃癌，1名为壶腹癌。中位随访时间为29个月。中位年龄为67岁，女性患者占多数。16名患者接受pembrolizumab治疗，3名接受nivolumab联合ipilimumab治疗。根据RECIST标准评估，9名患者（47%）出现客观影像学缓解，8名患者（42%）疾病稳定，2名患者（11%）出现疾病进展。
3.2 利用血浆来源的EV DNA和cfDNA确定和监测患者的MSI状态
从18名患者共采集了48份血浆样本进行分析。分离的EV具有典型的杯状形态（），平均直径为114±39纳米。
MSI分析显示，EV DNA在所有48份样本中均得到可分析结果。EV DNA与cfDNA之间的MSI检测结果具有93%的一致性（46对样本中有43对一致）。所有30名健康对照的EV和cfDNA均未检测到MSI信号。
在治疗前样本中，EV DNA检测到MSI信号的比例（10例中有7例，70%）显著高于治疗期间样本（38例中有6例，19%）。同样，cfDNA在治疗前样本中MSI信号的检出率（60%）也高于治疗期间（24%）。重要的是，在治疗前MSI阳性的患者中，除1例缺乏治疗期间样本外，其余6例患者在接受ICB治疗后，其EV MSI状态均转变为非MSI。这种转变与客观治疗反应（部分缓解）或疾病稳定相关（）。在4名患者中，从MSI到非MSI的转变发生在首次影像学评估（3个月）之前。
与匹配的肿瘤组织DNA进行比较，EV DNA和cfDNA中的等位基因谱与肿瘤组织DNA高度一致，强有力地支持了EV DNA和cfDNA的肿瘤源性。
3.3 接受ICB治疗患者的生存分析
患者的ICB治疗后中位总生存期（OS）为29个月，中位无进展生存期（PFS）为20个月。在亚组分析中，治疗期间EV MSI信号消失与否的患者，其OS或PFS未见显著差异。此外，研究者还分析了治疗前后cfDNA浓度的变化（）。结果显示，cfDNA浓度在治疗期间与治疗前的比值（D/B比值）≤1的患者，其PFS优于比值>1的患者。
4 讨论
本研究首次证明了血浆来源的EV中可检测到MSI信号。在ICB治疗开始前，EV DNA的MSI检测敏感性较高，而治疗期间检出率显著降低。大多数治疗前MSI阳性的患者在治疗期间转变为非MSI状态，且这种转变往往发生在首次影像学评估之前，并与临床获益相关。这可能是由于ICB诱导的疾病负荷减轻，导致携带MSI DNA的肿瘤源性EV数量减少。
尽管已有研究使用二代测序技术在cfDNA中灵敏地检测MSI，但本研究首次在ICB治疗患者中系统比较了EV DNA和cfDNA方法的性能，并显示出高度一致性。与半衰期短、对样本处理要求高的cfDNA相比，EV DNA因其受脂质双层保护而更稳定，且可能代表来自代谢活跃细胞的更具代表性的肿瘤DNA来源。此外，EV丰富的分子货物为未来整合多组学分析提供了潜力。综合这些优势，随着商业化EV分离试剂盒成本的下降，EV有望成为未来极具吸引力的分析物。
研究也存在局限性，包括样本采集时间点和间隔未标准化、队列规模较小（但在此罕见疾病背景下已是目前最全面的分析之一）、以及使用RECIST标准评估ICB反应可能不充分等。此外，未观察到基线EV MSI状态对患者生存的显著影响，很可能与样本量不足有关，需要在更大规模的研究中验证。
总之，本研究证明了使用基于单核苷酸的片段长度分析，可以在血浆EV DNA和cfDNA中检测到MSI信号。MSI状态在ICB治疗期间的动态变化可能是治疗反应的早期指标。其在ICB治疗动态监测中的性能，有待在多中心研究中进一步验证。
