《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Taohong Siwu Decoction Regulates MSC-Mediated H-Type Angiogenesis to Accelerate Bone Fracture Healing Through VHL/HIF-1α Ubiquitination
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本文通过体内外实验系统研究了桃红四物汤（TSD）促进骨折愈合的作用及分子机制。研究表明，TSD能通过调节pVHL/HIF-1α/VEGF信号轴，抑制HIF-1α泛素化降解，稳定HIF-1α，从而增强间充质干细胞（MSC）的归巢、增殖、迁移及其介导的H型血管生成，最终加速骨折愈合进程。其有效成分芍药苷被证实可直接结合pVHL发挥关键作用。本研究为传统中药TSD治疗骨折提供了新的科学依据和潜在的治疗靶点。
桃红四物汤（Taohong Siwu Decoction, TSD）是一种经典的中医活血化瘀方剂，由桃仁、红花、当归、熟地、川芎和白芍组成。本研究旨在探究TSD促进骨折愈合的作用及其深层机制。
TSD影响骨折小鼠愈合过程中的H型血管生成
研究首先构建了小鼠股骨骨折模型，并给予TSD干预7、14和21天。通过显微CT（micro-CT）扫描分析发现，与模型组相比，TSD干预组的骨体积分数（BV/TV）和骨密度（BMD）显著增加，其中TSD-14d组效果最为明显，表明TSD促进了骨折愈合并改善了愈合质量。H&E染色和番红O-固绿染色显示，模型组骨折端存在纤维和软骨骨痂，而TSD干预后骨痂大量形成，软骨生成逐渐增加。免疫荧光（IF）检测发现，模型组的血管标记物内皮粘蛋白（Endomucin, Emcn）和CD31表达显著低于假手术组，而TSD干预后其表达逐渐升高。此外，成骨标记物（Osterix, Runx2, MMP-9）和血管生成标记物（PDGF-BB, SLIT3）的水平在模型组受到抑制，但在TSD干预后逐渐升高。这些结果表明，TSD影响了骨折小鼠愈合过程中的H型血管生成。
TSD影响骨折小鼠愈合过程中MSC的归巢
间充质干细胞（MSC）表达特异性标志物CD90。免疫荧光结果显示，与假手术组相比，模型组的CD90表达降低。而在经过7、14和21天的TSD干预后，CD90表达逐渐增加。这提示TSD影响了骨折愈合过程中MSC向损伤部位的归巢。
TSD影响骨折小鼠愈合过程中的pVHL/HIF-1α/VEGF轴
通过Western blot评估了pVHL、HIF-1α、VEGF的表达水平以及HIF-1α的核表达。结果显示，与假手术组相比，模型组的HIF-1α、VEGF水平及HIF-1α核表达降低，而pVHL表达升高。经过7、14、21天的TSD治疗后，HIF-1α、VEGF水平及HIF-1α核表达逐渐升高，pVHL表达逐渐降低。这表明TSD在骨折愈合过程中影响了pVHL/HIF-1α/VEGF信号轴。
TSD增强MSC的增殖和迁移并抑制pVHL/HIF-1α的泛素化
体外细胞实验进一步验证了TSD的功能。用含10%TSD的血清处理MSC后，与对照血清组相比，MSC的活力和迁移能力增强。同时，HIF-1α和VEGF的水平、HIF-1α的核表达及其泛素化水平降低，而pVHL表达减少。免疫共沉淀（Co-IP）检测发现，与模型组相比，TSD组中pVHL与HIF-1α的相互作用减弱，表明TSD通过破坏pVHL介导的降解途径促进了HIF-1α的稳定。过表达VHL会降低HIF-1α水平，而使用蛋白酶体抑制剂MG132处理可逆转此效应。综上，TSD通过抑制pVHL/HIF-1α的泛素化，增强了MSC的增殖和迁移能力。
分子对接验证TSD中有效化合物与pVHL的结合
基于先前研究，在TSD中检测到五种化合物：阿魏酸、5-羟甲基糠醛、苦杏仁苷、羟基红花黄色素A和芍药苷。分子对接验证了这些化合物与pVHL的结合。结果显示，阿魏酸、苦杏仁苷、羟基红花黄色素A和芍药苷与pVHL具有较高的结合亲和力（结合能均<-5 kcal/mol），能够自发结合。其中，芍药苷的结合能最低（-8.1 kcal/mol），表明其结合最稳定。而5-羟甲基糠醛的结合能较弱（-4.4 kcal/mol）。后续的药物亲和响应靶点稳定性（DARTS）实验证实，芍药苷能与pVHL直接结合。高效液相色谱（HPLC）分析也在TSD组小鼠外周血中检测到了阿魏酸、苦杏仁苷、羟基红花黄色素A和芍药苷。
芍药苷通过pVHL/HIF-1α通路促进MSC增殖、迁移及血管生成
用不同浓度芍药苷处理MSC，发现80 μM芍药苷能最大程度提高MSC活力并最低程度降低pVHL蛋白水平，故选择此浓度进行后续研究。DARTS实验证实了芍药苷与pVHL的结合。与DMSO组相比，80 μM芍药苷处理增强了MSC的活力和迁移能力，并提高了HIF-1α、VEGF水平和HIF-1α核表达；而使用HIF-1α抑制剂2-甲氧基雌二醇（2-ME2）处理后，这些效应被逆转。从小鼠主动脉中成功分离并鉴定了内皮细胞（CD31阳性率97.91%）。将MSC与内皮细胞共培养后发现，芍药苷处理组的细胞活力、血管生成能力（节点数、网格数、总长度）均高于DMSO组，而2-ME2处理削弱了这些作用。进一步的机制研究表明，过表达VHL可减弱芍药苷对MSC活力、迁移、HIF-1α/VEGF表达以及促血管生成能力的提升作用。这些结果说明，芍药苷通过pVHL/HIF-1α通路促进MSC的增殖和迁移，进而增强血管生成。
TSD促进MSC的内皮血管生成
将MSC与内皮细胞共培养24小时，并用对照血清、10%TSD含药血清、以及10%TSD含药血清联合10 μM 2-ME2处理MSC。结果显示，与对照血清组相比，TSD含药血清组共培养体系的细胞活力和血管生成能力（节点数、网格数、总长度）均显著增强；而加入2-ME2后，这些促进作用被抑制。这表明TSD能促进MSC介导的内皮血管生成，且该过程依赖于HIF-1α。
结论
综上所述，本研究表明，桃红四物汤（TSD）能够通过调节VHL/HIF-1α的泛素化，稳定HIF-1α，激活下游VEGF表达，从而影响间充质干细胞（MSC）介导的H型血管生成，并促进MSC向骨折部位的归巢、增殖和迁移，最终加速骨折愈合。其中，芍药苷是TSD中通过结合pVHL发挥关键作用的有效成分之一。这些发现揭示了TSD促进骨折愈合的新机制，为其在临床上的应用提供了重要的理论依据。
